JoVE Journal > Immunology and Infection
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Abstract
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Immunology and Infection

マウスにおける腹腔組織常在マクロ ファージの 効率的な遺伝子およびマイクロRNA調節のためのレンチウイルスベクター調製

Published: February 16, 2024
doi:
10.3791/64926
, , , , , , ,
1Systems Immunity Research Institute, Division of Infection and Immunity,Cardiff University, 2Biomedical Sciences Unit, Faculty of Medicine, Health and Life Science,Swansea University, 3UK Dementia Research Institute

Summary

私たちは、レンチウイルスベクターを使用して、 in vivoで腹膜組織に常在するマクロファージの遺伝子機能を調べるための段階的なプロトコルを示します。

Abstract

腹膜組織に常在するマクロファージは、恒常性の維持に広範な機能を持ち、局所組織および隣接組織内の病状に関与しています。それらの機能は、微小環境の手がかりによって決定されます。したがって、 in vivo の生理学的ニッチにおける彼らの行動を調査することが不可欠です。現在、特定の腹膜マクロファージターゲティング方法論は、マウス全体のトランスジェニックモデルを採用しています。ここでは、レンチウイルス粒子を用いて腹膜マクロファージにおけるmRNAおよびsmall RNA種(例えば、microRNA)発現の効果的な in vivo 調節のためのプロトコルについて説明します。レンチウイルス製剤はHEK293T細胞で作製し、単一のスクロース層で精製しました。腹腔内注射後のレンチウイルスの有効性の in vivo 検証により、局所組織に限定されたマクロファージの主な感染が明らかになりました。腹膜マクロファージの標的化は、ホメオスタシスおよびチオグリコール酸誘発性腹膜炎において成功しました。レンチウイルスの腹腔内送達によって誘発される低レベルの炎症や、潜在的な実験の時間制限など、プロトコルの限界について説明します。全体として、この研究は、 in vivo の腹膜マクロファージにおける遺伝子機能を迅速に評価するための迅速でアクセス可能なプロトコルを示しています。

Introduction

組織常在性マクロファージ(Mφ)は、侵入する病原体を感知して応答する食作用免疫細胞の不均一な集団です1,2。さらに、それらは組織の発達、リモデリング、および恒常性の維持において重要な役割を果たします1,3。多くの組織Mφは、胚形成中に卵黄嚢前駆細胞に由来し、生涯を通じて組織に持続します4,5。これらの細胞の表現型と機能は、特定の転写因子と局所微小環境との協調的および階層的な相互作用によって決定される6,7,8,9。この依存性についての理解が深まるにつれ、生理学的に重要なニッチ内でMφを遺伝子操作するための効果的なin vivo法の必要性が高まっています。

レンチウイルスベクターは、in vivo 10,11,12の特定の細胞集団における核酸の操作に頻繁に使用されるツールであり、特に分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染し、宿主ゲノムに安定して統合する能力があるためです13,14。過去20年間で、レンチウイルス送達技術は最適化され、系統特異的なターゲティングを増やすために代替エンベロープと合成プロモーターが調査されてきた8,15。その広範な細胞親和性により、水疱性口内炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質(VSV-G)16,17は、レンチウイルス技術で使用される「ゴールドスタンダード」エンベロープとなっています。

このプロトコル18では、VSV-Gシュードタイプレンチウイルス粒子を使用して、短いヘアピンRNA(shRNA)およびマイクロRNA(miR)のマウス腹膜Mφ(pMφ)への定常状態でのインビボへの標的化および効果的な送達を実証する。導入遺伝子の発現は、脾臓焦点形成ウイルス(SFFV)プロモーターによって駆動されました。細胞の生産感染は、レンチウイルス由来の増強緑色蛍光タンパク質(GFP)の発現によって定義されました。このアプローチを利用することで、in vivoレンチウイルス実験の読み出しが容易になり、最適な用量と実験期間を定義することができました。最後に、チオグリコール酸誘発性炎症中のマウスのin vivoレンチウイルスチャレンジにより、選択的pMφ感染の自然な傾向が明らかになりました。

Protocol

すべての動物の作業は、機関および英国内務省のガイドラインに従って行われました。 注:レンチウイルスを用いたすべての in vivo 研究は、研究における動物の倫理的使用に関する地域および国のガイドラインに従って実施し、カテゴリーIIの感染性物質の使用に関連するすべての規制を遵守する必要があります。動物福祉も地域の規制に?…

Representative Results

完全かつ正しく従うと、このプロトコルは、1回の調製物あたり合計1.5mLの高品質レンチウイルスストックが得られ、この研究で決定された最適な量で12回の in vivo 注射に十分です18。トランスフェクションの成功は、プロトコールの早い段階で評価できます。健康でコンフルエントなHEK293T細胞は、プラスミド中に存在する場合、プラスミドト?…

Discussion

組織に常在するマクロファージは、その生理学的環境6,7,8,9によって決定されるさまざまな恒常性および炎症性の組織特異的機能1,2を実行します。このプロトコルでは、レンチウイルス粒子を使用してin vivoで腹膜に常在?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、全体的または部分的に、Wellcome Trust Investigator Award [107964/Z/15/Z] によって資金提供されました。PRTは、英国認知症研究所の支援も受けています。M.A.C.は、Biotechnology and Biological Sciences Research Council Discovery Fellowship(BB/T009543/1)の支援を受けています。オープンアクセスの目的で、著者は、この提出から生じる著者受理原稿バージョンにCC BY公開著作権ライセンスを適用しています。L.C.D.は、スウォンジー大学の講師であり、カーディフ大学の名誉研究員です。この研究は、Ipseiz et al. 2020,18.

Materials

0.05% Trypsin-EDTA (1x) (Trypsin 500 mg/L or 0.02 mM) Thermo Fisher Scientific 25300054
0.22 μm sterile millex GP filter Merck SLGS033SS
0.45 μm sterile millex GP filter Merck SLHP033RS
0.5 mL U-100 insulin syringe with needle, 0.33 mm x 12.7 mm (29 G) BD 324892
1 Litre Sharps Container N/A N/A
2.4G2 antibody (TruStain FcX anti-mouse CD16/32) Biolegend 101320
40 μm strainer Thermo Fisher Scientific 22363547
AimV medium (research grade), AlbuMax Supplement Thermo Fisher Scientific 31035025
Blocking buffer prepared in house
Brewer thioglycolate medium Sigma-Aldrich B2551 4% stock solution prepared in water, autoclaved and kept frozen.
CD11b Biolegend 101222 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11b BD 550993 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11c Biolegend 117317 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11c Biolegend 117333 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD19 BD 560375 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD19 Biolegend 152410 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD226 Biolegend 128808 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD3e BD 560527 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD3e Biolegend 152313 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD4 Biolegend 100412 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD73 eBioscience 16-0731-82 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD8a eBioscience 48-0081-82 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Cell culture flask (T175 fask, 175 cm2, 550 mL) Greiner Bio One 658175
Centrifuge tubes, conical bottom tubes 25 mm x 89 mm Beckman Coulter 358126
Centrifuges Beckman Coulter Ultracentrifuge and TC centrifuge
Collagenase type IV Sigma-Aldrich C5138
Conical centrifuge tubes (15 mL and 50 mL) Greiner Bio One 11512303 & 11849650
Cryotubes Greiner Bio One 123277 or cryotubes
DMEM medium (1x) + 4.5g/L D-glucose, 400 µM L-glutamine Thermo Fisher Scientific 41965-062
Dnase I Sigma-Aldrich 11284932001
Effectene transfection reagent Qiagen 301425
F4/80 Biolegend 123123 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
F4/80 Biolegend 123133 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
F4/80 Biolegend 123147 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
FceR1 eBioscience 48-5898-80 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Fetal calf serum (FCS)  Thermo Fisher Scientific 10270-106 heat inactivated for 30 min at 56 °C and sterile filtered through 0.22 μm filter
Flow cytometer Thermo Fisher Scientific  Attune NxT
Flow cytometry (FACS) buffer prepared in house
Fluorescent tissue culture microscope Thermo Fisher Scientific EVOS FL
Forceps N/A N/A User preference
Hank's balanced salt solution (HBSS) Gibco, Life Technologies 14175-053
HEK293T cell line grown for at least a week prior transfection. Mycoplasma free
HIV-1 Core antigen Beckman Coulter 6604667
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H3506
Hydrex surgical scrub, chlorhexiding gluconate 4% w/v skin cleanser Ecolab 3037170
I-A/I-E Biolegend 107625 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
ICAM1 Becton Dickinson 554970 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Jurkat T cell line grown for at least a week prior use. Mycoplasma free
LIVE/DEAD fixable near-IR dead cell stain kit Thermo Fisher Scientific L34975
Ly6G Biolegend 127615 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Mice here used C57BL/6 females, aged 8-12 weeks (Charles Rivers), unless specified differently
Microcapillary pipettes (volume range 0.5-1,000 μL) Fisher Scientific & Starlab 11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700
NK1.1 Biolegend 108724 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148-500G prepared to 2% w/v in PBS
pCMV-ΔR8.91 packaging plasmid Zuffrey, R., et al. 1997 encodes Gag-Pol HIV protein driven by cytomegalovirus promoter. Ampicilin resistance.
Penicillin/Streptomycin (100x, 10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122
Petri dish Greiner Bio One 664160
pHR'SIN-cPPT-SEW plasmid Rosas, M. et al. 2014 modified for shRNA and miR expression studies. Encodes EGFP marker downstream SFFV promoter and upstream of the Woodchuck hepatitiv virus enhancer. Ampicilin resistance.
pMD2.G plasmid Naldini, L. et al. 1996 encodes vesicular stomatis virus g-glycoprotein (VSV-G) envelope. Ampicilin resistance.
Rat IgG1, κ isotype control Becton Dickinson 550617 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Rat serum Sigma-Aldrich R9759-10ML
Red blood ACK lysis buffer prepared in house
RPMI 1640 medium (1x) + 400 uM L-glutamine Thermo Fisher Scientific 21875-091
Saponin Sigma-Aldrich S4521
SiglecF BD 562681 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Sodium hypochlorite Tablets (bleach, 2,000 ppm) Guest Medical H8818
Sterile 24-well cell culture plate Greiner Bio One 662160
Sterile Dulbecco's PBS (DPBS) (1x) Mg++ and Ca2+ – free Thermo Fisher Scientific 14190144
Sterile EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020
Sterile VWR disposable transfer pipets (23.0 mL, 30 cm) VWR 612-4515
Sucrose Thermo Fisher Scientific 15503022
surgical scissors N/A N/A User preference
Syringes (50 mL and 1 0mL) Fisher Scientific 10084450 & 768160
Tim4 Biolegend 130007 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
U-bottom 96-well cell culture plate Greiner Bio One 650180
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References

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