JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

تحضير ناقل Lentiviral لتعديل الجينات والحمض النووي الريبي الدقيق الفعال للبلاعم المقيمة في أنسجة التجويف البريتوني في الجسم الحي في الفئران

Published: February 16, 2024
doi:
10.3791/64926
, , , , , , ,
1Systems Immunity Research Institute, Division of Infection and Immunity,Cardiff University, 2Biomedical Sciences Unit, Faculty of Medicine, Health and Life Science,Swansea University, 3UK Dementia Research Institute

Summary

نعرض بروتوكولا خطوة بخطوة للتحقيق في وظيفة الجينات في الضامة المقيمة في الأنسجة البريتونية في الجسم الحي ، باستخدام ناقلات الفيروسات العدسية.

Abstract

الضامة المقيمة في الأنسجة البريتونية لها وظائف واسعة في الحفاظ على التوازن وتشارك في الأمراض داخل الأنسجة المحلية والمجاورة. وظائفها تمليها الإشارات البيئية الدقيقة. وبالتالي ، من الضروري التحقيق في سلوكهم في مكانة فسيولوجية في الجسم الحي . في الوقت الحالي ، تستخدم منهجيات محددة لاستهداف البلاعم البريتونية نماذج معدلة وراثيا للفأر الكامل. هنا ، يتم وصف بروتوكول للتعديل الفعال في الجسم الحي ل mRNA وأنواع الحمض النووي الريبي الصغيرة (على سبيل المثال ، microRNA) في البلاعم البريتونية باستخدام جزيئات الفيروس العدسي. تم إجراء مستحضرات Lentivirus في خلايا HEK293T وتنقيتها على طبقة سكروز واحدة. كشف التحقق من فعالية الفيروس العدسي في الجسم الحي بعد الحقن داخل الصفاق عن العدوى السائدة للبلاعم المقتصرة على الأنسجة المحلية. كان استهداف البلاعم البريتونية ناجحا أثناء التوازن والتهاب الصفاق الناجم عن الثيوغليكولات. تتم مناقشة قيود البروتوكول ، بما في ذلك الالتهاب منخفض المستوى الناجم عن التوصيل داخل الصفاق لفيروس lentivirus والقيود الزمنية للتجارب المحتملة. بشكل عام ، تقدم هذه الدراسة بروتوكولا سريعا ويمكن الوصول إليه للتقييم السريع لوظيفة الجينات في الضامة البريتونية في الجسم الحي.

Introduction

البلاعم المقيمة في الأنسجة (Mφ) هي مجموعة غير متجانسة من الخلايا المناعية البلعمية التي تستشعر مسببات الأمراض الغازية وتستجيب لها 1,2. بالإضافة إلى ذلك ، فإنها تلعب دورا أساسيا في تطوير الأنسجة ، وإعادة تشكيلها ، والحفاظ على التوازن 1,3. العديد من الأنسجة Mφ مستمدة من أسلاف كيس الصفار أثناء التطور الجنيني وتستمر في الأنسجة طوال الحياة 4,5. يتم تحديد النمط الظاهري ووظائف هذه الخلايا من خلال التفاعلات التعاونية والهرمية لعوامل النسخ المحددة والبيئة المكرويةالمحلية 6،7،8،9. يزيد الفهم المتزايد لهذه التبعية من الحاجة إلى طرق فعالة في الجسم الحي لمعالجة الجينات ل Mφ ضمن مكانتها ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية.

النواقل الفيروسية هي أداة تستخدم بشكل متكرر لمعالجة الأحماض النووية في مجموعات خلايا معينة في الجسم الحي10،11،12 ، لا سيما بسبب قدرتها على إصابة كل من الخلايا المنقسمة وغير المنقسمة والاندماج بثبات في الجينوم المضيف13،14. على مدى العقدين الماضيين ، تم تحسين تقنية توصيل فيروس lentivirus ، وتم التحقيق في المغلفات البديلة والمروجين الاصطناعية لزيادة استهداف النسبالمحدد 8,15. نظرا لانتحاء الخلية الواسع ، أصبح البروتين السكري المغلف بفيروس التهاب الفم الحويصلي (VSV-G)16,17 هو المغلف “القياسي الذهبي” المستخدم في تقنية الفيروسات العدسية.

في هذا البروتوكول18 ، يتم استخدام جزيئات الفيروسات العدسية ذات النمط الكاذب VSV-G لإثبات التوصيل المستهدف والفعال للحمض النووي الريبي قصير الدبوس (shRNA) والحمض النووي الريبي الدقيق (miR) إلى الماوس البريتوني Mφ (pMφ) في الجسم الحي ، في الحالة المستقرة19. كان التعبير الجيني المحوري مدفوعا بمروج فيروس تشكيل تركيز الطحال (SFFV). تم تعريف العدوى المنتجة للخلايا من خلال التعبير عن البروتين الفلوري الأخضر المعزز المشتق من فيروس العدس (GFP). سمح استخدام هذا النهج بقراءات سهلة لتجارب الفيروس العدسي في الجسم الحي لتحديد الجرعة المثلى والإطار الزمني التجريبي. أخيرا ، كشف التحدي الفيروسي العدسي في الجسم الحي للفئران أثناء الالتهاب الناجم عن الثيوغليكولات عن الميل الطبيعي لعدوى pMφ الانتقائية.

Protocol

تم إجراء جميع الأعمال الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية ووزارة الداخلية في المملكة المتحدة. ملاحظة: يجب إجراء جميع الدراسات في الجسم الحي مع فيروس lentivirus وفقا للمبادئ التوجيهية المحلية والوطنية بشأن الاستخدام الأخلاقي للحيوانات في البحث ، و…

Representative Results

عند اتباع هذا البروتوكول بشكل كامل وصحيح ، ينتج ما مجموعه 1.5 مل من مخزون فيروس العدس عالي الجودة لكل مستحضر واحد ، وهو ما يكفي لاثني عشر حقنة في الجسم الحي بالحجم الأمثل المحدد في هذه الدراسة18. يمكن تقييم نجاح النقل في وقت مبكر من البروتوكول. يجب أن تعرض خ…

Discussion

تؤدي البلاعم المقيمة في الأنسجة مجموعة من الوظائف الخاصة بالأنسجة الاستتبابيةوالالتهابية 1,2 التي تمليها بيئتهاالفسيولوجية 6،7،8،9. في هذا البروتوكول ، تم تقديم طريقة ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم تمويل هذا البحث ، كليا أو جزئيا ، من خلال جائزة Wellcome Trust Investigator [107964 / Z / 15 / Z]. يتم دعم P.R.T أيضا من قبل معهد أبحاث الخرف في المملكة المتحدة. يتم دعم MAC من قبل زمالة اكتشاف مجلس أبحاث التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية (BB / T009543 / 1). لغرض الوصول المفتوح ، قام المؤلف بتطبيق ترخيص حقوق الطبع والنشر العام CC BY على أي نسخة مخطوطة مقبولة من المؤلف تنشأ عن هذا التقديم. L.C.D محاضر في جامعة سوانسي وزميل باحث فخري في جامعة كارديف. هذا العمل مدعوم بالعمل الذي قام به Ipseiz et al. 202018.

Materials

0.05% Trypsin-EDTA (1x) (Trypsin 500 mg/L or 0.02 mM) Thermo Fisher Scientific 25300054
0.22 μm sterile millex GP filter Merck SLGS033SS
0.45 μm sterile millex GP filter Merck SLHP033RS
0.5 mL U-100 insulin syringe with needle, 0.33 mm x 12.7 mm (29 G) BD 324892
1 Litre Sharps Container N/A N/A
2.4G2 antibody (TruStain FcX anti-mouse CD16/32) Biolegend 101320
40 μm strainer Thermo Fisher Scientific 22363547
AimV medium (research grade), AlbuMax Supplement Thermo Fisher Scientific 31035025
Blocking buffer prepared in house
Brewer thioglycolate medium Sigma-Aldrich B2551 4% stock solution prepared in water, autoclaved and kept frozen.
CD11b Biolegend 101222 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11b BD 550993 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11c Biolegend 117317 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11c Biolegend 117333 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD19 BD 560375 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD19 Biolegend 152410 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD226 Biolegend 128808 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD3e BD 560527 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD3e Biolegend 152313 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD4 Biolegend 100412 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD73 eBioscience 16-0731-82 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD8a eBioscience 48-0081-82 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Cell culture flask (T175 fask, 175 cm2, 550 mL) Greiner Bio One 658175
Centrifuge tubes, conical bottom tubes 25 mm x 89 mm Beckman Coulter 358126
Centrifuges Beckman Coulter Ultracentrifuge and TC centrifuge
Collagenase type IV Sigma-Aldrich C5138
Conical centrifuge tubes (15 mL and 50 mL) Greiner Bio One 11512303 & 11849650
Cryotubes Greiner Bio One 123277 or cryotubes
DMEM medium (1x) + 4.5g/L D-glucose, 400 µM L-glutamine Thermo Fisher Scientific 41965-062
Dnase I Sigma-Aldrich 11284932001
Effectene transfection reagent Qiagen 301425
F4/80 Biolegend 123123 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
F4/80 Biolegend 123133 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
F4/80 Biolegend 123147 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
FceR1 eBioscience 48-5898-80 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Fetal calf serum (FCS)  Thermo Fisher Scientific 10270-106 heat inactivated for 30 min at 56 °C and sterile filtered through 0.22 μm filter
Flow cytometer Thermo Fisher Scientific  Attune NxT
Flow cytometry (FACS) buffer prepared in house
Fluorescent tissue culture microscope Thermo Fisher Scientific EVOS FL
Forceps N/A N/A User preference
Hank's balanced salt solution (HBSS) Gibco, Life Technologies 14175-053
HEK293T cell line grown for at least a week prior transfection. Mycoplasma free
HIV-1 Core antigen Beckman Coulter 6604667
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H3506
Hydrex surgical scrub, chlorhexiding gluconate 4% w/v skin cleanser Ecolab 3037170
I-A/I-E Biolegend 107625 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
ICAM1 Becton Dickinson 554970 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Jurkat T cell line grown for at least a week prior use. Mycoplasma free
LIVE/DEAD fixable near-IR dead cell stain kit Thermo Fisher Scientific L34975
Ly6G Biolegend 127615 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Mice here used C57BL/6 females, aged 8-12 weeks (Charles Rivers), unless specified differently
Microcapillary pipettes (volume range 0.5-1,000 μL) Fisher Scientific & Starlab 11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700
NK1.1 Biolegend 108724 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148-500G prepared to 2% w/v in PBS
pCMV-ΔR8.91 packaging plasmid Zuffrey, R., et al. 1997 encodes Gag-Pol HIV protein driven by cytomegalovirus promoter. Ampicilin resistance.
Penicillin/Streptomycin (100x, 10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122
Petri dish Greiner Bio One 664160
pHR'SIN-cPPT-SEW plasmid Rosas, M. et al. 2014 modified for shRNA and miR expression studies. Encodes EGFP marker downstream SFFV promoter and upstream of the Woodchuck hepatitiv virus enhancer. Ampicilin resistance.
pMD2.G plasmid Naldini, L. et al. 1996 encodes vesicular stomatis virus g-glycoprotein (VSV-G) envelope. Ampicilin resistance.
Rat IgG1, κ isotype control Becton Dickinson 550617 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Rat serum Sigma-Aldrich R9759-10ML
Red blood ACK lysis buffer prepared in house
RPMI 1640 medium (1x) + 400 uM L-glutamine Thermo Fisher Scientific 21875-091
Saponin Sigma-Aldrich S4521
SiglecF BD 562681 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Sodium hypochlorite Tablets (bleach, 2,000 ppm) Guest Medical H8818
Sterile 24-well cell culture plate Greiner Bio One 662160
Sterile Dulbecco's PBS (DPBS) (1x) Mg++ and Ca2+ – free Thermo Fisher Scientific 14190144
Sterile EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020
Sterile VWR disposable transfer pipets (23.0 mL, 30 cm) VWR 612-4515
Sucrose Thermo Fisher Scientific 15503022
surgical scissors N/A N/A User preference
Syringes (50 mL and 1 0mL) Fisher Scientific 10084450 & 768160
Tim4 Biolegend 130007 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
U-bottom 96-well cell culture plate Greiner Bio One 650180
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  2. Jantsch, J., Binger, K. J., Muller, D. N., Titze, J. Macrophages in homeostatic immune function. Front Physiol. 5, 146 (2014).
  3. Wynn, T. A., Vannella, K. M. Macrophages in tissue repair, regeneration, and fibrosis. Immunity. 44 (3), 450-462 (2016).
  4. Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
  5. Epelman, S., Lavine, K. J., Randolph, G. J. Origin and functions of tissue macrophages. Immunity. 41 (1), 21-35 (2014).
  6. Amit, I., Winter, D. R., Jung, S. The role of the local environment and epigenetics in shaping macrophage identity and their effect on tissue homeostasis. Nat Immunol. 17 (1), 18-25 (2016).
  7. Gosselin, D., et al. Environment drives selection and function of enhancers controlling tissue-specific macrophage identities. Cell. 159 (6), 1327-1340 (2014).
  8. Lavin, Y., et al. Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment. Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).
  9. Davies, L. C., et al. Peritoneal tissue-resident macrophages are metabolically poised to engage microbes using tissue-niche fuels. Nat Commun. 8 (1), 2047 (2017).
  10. Shi, J., Hua, L., Harmer, D., Li, P., Ren, G. Cre driver mice targeting macrophages. Methods Mol Biol. 1784, 263-275 (2018).
  11. Wang, X., et al. Recent advances in lentiviral vectors for gene therapy. Sci China Life Sci. 64 (11), 1842-1857 (2021).
  12. Kosaka, Y., et al. Lentivirus-based gene delivery in mouse embryonic stem cells. Artif Organs. 28 (3), 271-277 (2004).
  13. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
  14. Yamashita, M., Emerman, M. Capsid is a dominant determinant of retrovirus infectivity in nondividing cells. J Virol. 78 (11), 5670-5678 (2004).
  15. Wilson, A. A., et al. Lentiviral delivery of RNAi for in vivo lineage-specific modulation of gene expression in mouse lung macrophages. Mol Ther. 21 (4), 825-833 (2013).
  16. Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).
  17. Finkelshtein, D., Werman, A., Novick, D., Barak, S., Rubinstein, M. LDL receptor and its family members serve as the cellular receptors for vesicular stomatitis virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (18), 7306-7311 (2013).
  18. Ipseiz, N., et al. Effective in vivo gene modification in mouse tissue-resident peritoneal macrophages by intraperitoneal delivery of lentiviral vectors. Mol Ther Methods Clin Dev. 16, 21-31 (2020).
  19. Rosas, M., et al. The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal. Science. 344 (6184), 645-648 (2014).
  20. . Available from: https://www.mybeckman.uk/resources/technologies/centrifugation/principles/rotor-balancing (2023)
  21. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques. , (2023).
  22. Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nat Biotechnol. 15 (9), 871-875 (1997).
  23. Nasri, M., Karimi, A., Allahbakhshian Farsani, M. Production, purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes. Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).
  24. al Yacoub, N., Romanowska, M., Haritonova, N., Foerster, J. Optimized production and concentration of lentiviral vectors containing large inserts. J Gene Med. 9 (7), 579-584 (2007).
  25. Malim, M. H., Bieniasz, P. D. HIV restriction factors and mechanisms of evasion. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006940 (2012).
  26. Sonza, S., et al. Susceptibility of human monocytes to HIV type 1 infection in vitro is not dependent on their level of CD4 expression. AIDS Res Hum Retroviruses. 11 (7), 769-776 (1995).
  27. Kingston, R. E., Chen, C. A., Rose, J. K. Calcium phosphate transfection. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 9, Unit 9.1 (2003).
  28. Brown, L. Y., Dong, W., Kantor, B. An Improved protocol for the production of lentiviral vectors. STAR Protoc. 1 (3), 100152 (2020).
  29. Moce-Llivina, L., Jofre, J., Muniesa, M. Comparison of polyvinylidene fluoride and polyether sulfone membranes in filtering viral suspensions. J Virol Methods. 109 (1), 99-101 (2003).
  30. Jiang, W., et al. An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation. Sci Rep. 5, 13875 (2015).
  31. Czubala, M. A., et al. TGFbeta induces a SAMHD1-independent post-entry restriction to HIV-1 infection of human epithelial langerhans cells. J Invest Dermatol. 136 (10), 1981-1989 (2016).
  32. Bouabe, H., Okkenhaug, K. Gene targeting in mice: a review. Methods Mol Biol. 1064, 315-336 (2013).
  33. Kim, J. M., Rasmussen, J. P., Rudensky, A. Y. Regulatory T cells prevent catastrophic autoimmunity throughout the lifespan of mice. Nat Immunol. 8 (2), 191-197 (2007).
  34. Decalf, J., et al. Sensing of HIV-1 entry triggers a Type I Interferon response in human primary macrophages. J Virol. 91 (15), e00147-e00217 (2017).
  35. Wilson, A. A., et al. Amelioration of emphysema in mice through lentiviral transduction of long-lived pulmonary alveolar macrophages. J Clin Invest. 120 (1), 379-389 (2010).
  36. Markusic, D. M., van Til, N. P., Hiralall, J. K., Elferink, R. P., Seppen, J. Reduction of liver macrophage transduction by pseudotyping lentiviral vectors with a fusion envelope from Autographa californica GP64 and Sendai virus F2 domain. BMC Biotechnol. 9, 85 (2009).
  37. Burke, B., Sumner, S., Maitland, N., Lewis, C. E. Macrophages in gene therapy: cellular delivery vehicles and in vivo targets. J Leukoc Biol. 72 (3), 417-428 (2002).
  38. Bain, C. C., Jenkins, S. J. The biology of serous cavity macrophages. Cell Immunol. 330, 126-135 (2018).
  39. Milone, M. C., O’Doherty, U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia. 32 (7), 1529-1541 (2018).

Tags

Lentiviral VectorGene ModulationMicroRNA ModulationPeritoneal MacrophagesIn VivoHomeostasisPeritonitisHEK293T CellsSucrose PurificationIntraperitoneal InjectionGene Function

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Gurney, M., Davies, L. C., Jones, R. E., Bart, V. M., Jenkins, R. H., Brennan, P., Taylor, P. R., Czubala, M. A. Lentiviral Vector Preparation for Efficient Gene and MicroRNA Modulation of Peritoneal Cavity Tissue-Resident Macrophages In Vivo in Mice. J. Vis. Exp. (204), e64926, doi:10.3791/64926 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image