JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Deutsch

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Lentivirale Vektorpräparation für die effiziente Gen- und microRNA-Modulation von geweberesidenten Makrophagen in der Bauchhöhle in vivo bei Mäusen

Published: February 16, 2024
doi:
10.3791/64926
, , , , , , ,
1Systems Immunity Research Institute, Division of Infection and Immunity,Cardiff University, 2Biomedical Sciences Unit, Faculty of Medicine, Health and Life Science,Swansea University, 3UK Dementia Research Institute

Summary

Wir demonstrieren ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Untersuchung der Genfunktion in peritonealen Gewebe-residenten Makrophagen in vivo unter Verwendung lentiviraler Vektoren.

Abstract

Im Peritonealgewebe residente Makrophagen haben weitreichende Funktionen bei der Aufrechterhaltung der Homöostase und sind an Pathologien in lokalen und benachbarten Geweben beteiligt. Ihre Funktionen werden von Mikroumgebungsreizen diktiert; Daher ist es wichtig, ihr Verhalten in einer physiologischen Nische in vivo zu untersuchen. Derzeit verwenden spezifische Peritonealmakrophagen-Targeting-Methoden transgene Modelle der ganzen Maus. Hier wird ein Protokoll zur effektiven in vivo Modulation der Expression von mRNA und kleinen RNA-Spezies (z.B. microRNA) in Peritonealmakrophagen unter Verwendung von Lentiviruspartikeln beschrieben. Lentivirus-Präparate wurden in HEK293T Zellen hergestellt und auf einer einzigen Saccharoseschicht gereinigt. Die In-vivo-Validierung der Wirksamkeit von Lentiviren nach intraperitonealer Injektion ergab eine vorherrschende Infektion von Makrophagen, die auf lokales Gewebe beschränkt waren. Das Targeting von Peritonealmakrophagen war während der Homöostase und der Thioglykolat-induzierten Peritonitis erfolgreich. Die Einschränkungen des Protokolls, einschließlich der durch die intraperitoneale Verabreichung von Lentiviren induzierten Entzündung auf niedrigem Niveau und der Zeitbeschränkungen für mögliche Experimente, werden diskutiert. Insgesamt stellt diese Studie ein schnelles und zugängliches Protokoll für die schnelle Beurteilung der Genfunktion in peritonealen Makrophagen in vivo dar.

Introduction

Geweberesidente Makrophagen (Mφ) sind eine heterogene Population phagozytärer Immunzellen, die eindringende Krankheitserreger wahrnehmen und darauf reagieren 1,2. Darüber hinaus spielen sie eine wesentliche Rolle bei der Gewebeentwicklung, dem Umbau und der Aufrechterhaltung der Homöostase 1,3. Viele Gewebe-Mφ stammen während der Embryogenese von Dottersack-Vorläufern ab und verbleiben während des gesamten Lebens im Gewebe 4,5. Der Phänotyp und die Funktionen dieser Zellen werden durch kollaborative und hierarchische Wechselwirkungen spezifischer Transkriptionsfaktoren und der lokalen Mikroumgebung bestimmt 6,7,8,9. Ein wachsendes Verständnis dieser Abhängigkeit erhöht den Bedarf an effektiven in vivo Methoden zur Genmanipulation von Mφ in ihrer physiologisch relevanten Nische.

Lentivirale Vektoren sind ein häufig eingesetztes Werkzeug zur Manipulation von Nukleinsäuren in spezifischen Zellpopulationen in vivo 10,11,12, insbesondere aufgrund ihrer Fähigkeit, sowohl sich teilende als auch nicht teilende Zellen zu infizieren und sich stabil in das Wirtsgenom zu integrieren 13,14. In den letzten zwei Jahrzehnten wurde die Lentivirus-Verabreichungstechnologie optimiert, und es wurden alternative Hüllkurven und synthetische Promotoren untersucht, um das linienspezifische Targeting zu erhöhen 8,15. Aufgrund seines breiten Zelltropismus hat sich das vesikuläre Stomatitis-Virus-Hüllglykoprotein (VSV-G)16,17 zum “Goldstandard” in der Lentivirus-Technologie entwickelt.

In diesem Protokoll18 werden VSV-G-pseudotypisierte lentivirale Partikel verwendet, um die gezielte und effektive Verabreichung von Short Hairpin-RNA (shRNA) und microRNA (miR) an peritoneale Mφ (pMφ) der Maus in vivo im Steady State19 zu demonstrieren. Die Transgenexpression wurde durch den Promotor des Milzfokusbildenden Virus (SFFV) gesteuert. Die produktive Infektion von Zellen wurde durch die Expression des von Lentiviren abgeleiteten verstärkten grün fluoreszierenden Proteins (GFP) definiert. Die Verwendung dieses Ansatzes ermöglichte eine einfache Auslesung für in vivo Lentivirus-Experimente, um die optimale Dosis und den experimentellen Zeitrahmen zu definieren. Schließlich zeigte die in vivo lentivirale Provokation von Mäusen während einer Thioglykolat-induzierten Entzündung die natürliche Neigung zur selektiven pMφ-Infektion.

Protocol

Alle Tierarbeiten wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Institution und des britischen Innenministeriums durchgeführt. HINWEIS: Alle In-vivo-Studien mit Lentiviren sollten gemäß den lokalen und nationalen Richtlinien für die ethische Verwendung von Tieren in der Forschung sowie unter Einhaltung aller Vorschriften im Zusammenhang mit der Verwendung von infektiösem Material der Kategorie II durchgeführt werden. Auch der Tierschutz sol…

Representative Results

Bei vollständiger und korrekter Befolgung dieses Protokolls ergibt sich eine Gesamtmenge von 1,5 ml hochwertiger Lentivirus-Brühe pro Einzelpräparat, ausreichend für zwölf In-vivo-Injektionen mit dem in dieser Studie ermittelten optimalen Volumen18. Der Erfolg der Transfektion kann bereits zu Beginn des Protokolls beurteilt werden. Gesunde und konfluente HEK293T Zellen sollten, falls in den Plasmiden vorhanden, 48 Stunden nach der Plasmidtransfektion…

Discussion

Geweberesidente Makrophagen erfüllen eine Reihe von homöostatischen und entzündlichen gewebespezifischen Funktionen 1,2, die von ihrer physiologischen Umgebung diktiertwerden 6,7,8,9. In diesem Protokoll wurde ein wirksames Verfahren18 zur Manipulation von peritonealen residen…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Forschung wurde ganz oder teilweise durch den Wellcome Trust Investigator Award [107964/Z/15/Z] finanziert. P.R.T. wird auch vom UK Dementia Research Institute unterstützt. M.A.C. wird durch das Biotechnology and Biological Sciences Research Council Discovery Fellowship (BB/T009543/1) unterstützt. Für die Zwecke des Open Access hat der Autor eine CC BY-Lizenz für das öffentliche Urheberrecht auf jede vom Autor akzeptierte Manuskriptversion angewendet, die sich aus dieser Einreichung ergibt. L.C.D. ist Dozent an der Swansea University und Honorary Research Fellow an der Cardiff University. Diese Arbeit wird durch Arbeiten von Ipseiz et al. 202018 unterstützt.

Materials

0.05% Trypsin-EDTA (1x) (Trypsin 500 mg/L or 0.02 mM) Thermo Fisher Scientific 25300054
0.22 μm sterile millex GP filter Merck SLGS033SS
0.45 μm sterile millex GP filter Merck SLHP033RS
0.5 mL U-100 insulin syringe with needle, 0.33 mm x 12.7 mm (29 G) BD 324892
1 Litre Sharps Container N/A N/A
2.4G2 antibody (TruStain FcX anti-mouse CD16/32) Biolegend 101320
40 μm strainer Thermo Fisher Scientific 22363547
AimV medium (research grade), AlbuMax Supplement Thermo Fisher Scientific 31035025
Blocking buffer prepared in house
Brewer thioglycolate medium Sigma-Aldrich B2551 4% stock solution prepared in water, autoclaved and kept frozen.
CD11b Biolegend 101222 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11b BD 550993 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11c Biolegend 117317 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD11c Biolegend 117333 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD19 BD 560375 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD19 Biolegend 152410 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD226 Biolegend 128808 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD3e BD 560527 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD3e Biolegend 152313 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD4 Biolegend 100412 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD73 eBioscience 16-0731-82 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
CD8a eBioscience 48-0081-82 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Cell culture flask (T175 fask, 175 cm2, 550 mL) Greiner Bio One 658175
Centrifuge tubes, conical bottom tubes 25 mm x 89 mm Beckman Coulter 358126
Centrifuges Beckman Coulter Ultracentrifuge and TC centrifuge
Collagenase type IV Sigma-Aldrich C5138
Conical centrifuge tubes (15 mL and 50 mL) Greiner Bio One 11512303 & 11849650
Cryotubes Greiner Bio One 123277 or cryotubes
DMEM medium (1x) + 4.5g/L D-glucose, 400 µM L-glutamine Thermo Fisher Scientific 41965-062
Dnase I Sigma-Aldrich 11284932001
Effectene transfection reagent Qiagen 301425
F4/80 Biolegend 123123 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
F4/80 Biolegend 123133 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
F4/80 Biolegend 123147 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
FceR1 eBioscience 48-5898-80 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Fetal calf serum (FCS)  Thermo Fisher Scientific 10270-106 heat inactivated for 30 min at 56 °C and sterile filtered through 0.22 μm filter
Flow cytometer Thermo Fisher Scientific  Attune NxT
Flow cytometry (FACS) buffer prepared in house
Fluorescent tissue culture microscope Thermo Fisher Scientific EVOS FL
Forceps N/A N/A User preference
Hank's balanced salt solution (HBSS) Gibco, Life Technologies 14175-053
HEK293T cell line grown for at least a week prior transfection. Mycoplasma free
HIV-1 Core antigen Beckman Coulter 6604667
Hyaluronidase Sigma-Aldrich H3506
Hydrex surgical scrub, chlorhexiding gluconate 4% w/v skin cleanser Ecolab 3037170
I-A/I-E Biolegend 107625 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
ICAM1 Becton Dickinson 554970 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Jurkat T cell line grown for at least a week prior use. Mycoplasma free
LIVE/DEAD fixable near-IR dead cell stain kit Thermo Fisher Scientific L34975
Ly6G Biolegend 127615 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Mice here used C57BL/6 females, aged 8-12 weeks (Charles Rivers), unless specified differently
Microcapillary pipettes (volume range 0.5-1,000 μL) Fisher Scientific & Starlab 11963466 & 11943466 & 11973466 & S1111-3700
NK1.1 Biolegend 108724 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148-500G prepared to 2% w/v in PBS
pCMV-ΔR8.91 packaging plasmid Zuffrey, R., et al. 1997 encodes Gag-Pol HIV protein driven by cytomegalovirus promoter. Ampicilin resistance.
Penicillin/Streptomycin (100x, 10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140122
Petri dish Greiner Bio One 664160
pHR'SIN-cPPT-SEW plasmid Rosas, M. et al. 2014 modified for shRNA and miR expression studies. Encodes EGFP marker downstream SFFV promoter and upstream of the Woodchuck hepatitiv virus enhancer. Ampicilin resistance.
pMD2.G plasmid Naldini, L. et al. 1996 encodes vesicular stomatis virus g-glycoprotein (VSV-G) envelope. Ampicilin resistance.
Rat IgG1, κ isotype control Becton Dickinson 550617 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Rat serum Sigma-Aldrich R9759-10ML
Red blood ACK lysis buffer prepared in house
RPMI 1640 medium (1x) + 400 uM L-glutamine Thermo Fisher Scientific 21875-091
Saponin Sigma-Aldrich S4521
SiglecF BD 562681 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
Sodium hypochlorite Tablets (bleach, 2,000 ppm) Guest Medical H8818
Sterile 24-well cell culture plate Greiner Bio One 662160
Sterile Dulbecco's PBS (DPBS) (1x) Mg++ and Ca2+ – free Thermo Fisher Scientific 14190144
Sterile EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020
Sterile VWR disposable transfer pipets (23.0 mL, 30 cm) VWR 612-4515
Sucrose Thermo Fisher Scientific 15503022
surgical scissors N/A N/A User preference
Syringes (50 mL and 1 0mL) Fisher Scientific 10084450 & 768160
Tim4 Biolegend 130007 Refer to Table 1 for the dilution and concentration
U-bottom 96-well cell culture plate Greiner Bio One 650180
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
  2. Jantsch, J., Binger, K. J., Muller, D. N., Titze, J. Macrophages in homeostatic immune function. Front Physiol. 5, 146 (2014).
  3. Wynn, T. A., Vannella, K. M. Macrophages in tissue repair, regeneration, and fibrosis. Immunity. 44 (3), 450-462 (2016).
  4. Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
  5. Epelman, S., Lavine, K. J., Randolph, G. J. Origin and functions of tissue macrophages. Immunity. 41 (1), 21-35 (2014).
  6. Amit, I., Winter, D. R., Jung, S. The role of the local environment and epigenetics in shaping macrophage identity and their effect on tissue homeostasis. Nat Immunol. 17 (1), 18-25 (2016).
  7. Gosselin, D., et al. Environment drives selection and function of enhancers controlling tissue-specific macrophage identities. Cell. 159 (6), 1327-1340 (2014).
  8. Lavin, Y., et al. Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment. Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).
  9. Davies, L. C., et al. Peritoneal tissue-resident macrophages are metabolically poised to engage microbes using tissue-niche fuels. Nat Commun. 8 (1), 2047 (2017).
  10. Shi, J., Hua, L., Harmer, D., Li, P., Ren, G. Cre driver mice targeting macrophages. Methods Mol Biol. 1784, 263-275 (2018).
  11. Wang, X., et al. Recent advances in lentiviral vectors for gene therapy. Sci China Life Sci. 64 (11), 1842-1857 (2021).
  12. Kosaka, Y., et al. Lentivirus-based gene delivery in mouse embryonic stem cells. Artif Organs. 28 (3), 271-277 (2004).
  13. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
  14. Yamashita, M., Emerman, M. Capsid is a dominant determinant of retrovirus infectivity in nondividing cells. J Virol. 78 (11), 5670-5678 (2004).
  15. Wilson, A. A., et al. Lentiviral delivery of RNAi for in vivo lineage-specific modulation of gene expression in mouse lung macrophages. Mol Ther. 21 (4), 825-833 (2013).
  16. Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).
  17. Finkelshtein, D., Werman, A., Novick, D., Barak, S., Rubinstein, M. LDL receptor and its family members serve as the cellular receptors for vesicular stomatitis virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (18), 7306-7311 (2013).
  18. Ipseiz, N., et al. Effective in vivo gene modification in mouse tissue-resident peritoneal macrophages by intraperitoneal delivery of lentiviral vectors. Mol Ther Methods Clin Dev. 16, 21-31 (2020).
  19. Rosas, M., et al. The transcription factor Gata6 links tissue macrophage phenotype and proliferative renewal. Science. 344 (6184), 645-648 (2014).
  20. . Available from: https://www.mybeckman.uk/resources/technologies/centrifugation/principles/rotor-balancing (2023)
  21. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Rodent Handling and Restraint Techniques. , (2023).
  22. Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nat Biotechnol. 15 (9), 871-875 (1997).
  23. Nasri, M., Karimi, A., Allahbakhshian Farsani, M. Production, purification and titration of a lentivirus-based vector for gene delivery purposes. Cytotechnology. 66 (6), 1031-1038 (2014).
  24. al Yacoub, N., Romanowska, M., Haritonova, N., Foerster, J. Optimized production and concentration of lentiviral vectors containing large inserts. J Gene Med. 9 (7), 579-584 (2007).
  25. Malim, M. H., Bieniasz, P. D. HIV restriction factors and mechanisms of evasion. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (5), a006940 (2012).
  26. Sonza, S., et al. Susceptibility of human monocytes to HIV type 1 infection in vitro is not dependent on their level of CD4 expression. AIDS Res Hum Retroviruses. 11 (7), 769-776 (1995).
  27. Kingston, R. E., Chen, C. A., Rose, J. K. Calcium phosphate transfection. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 9, Unit 9.1 (2003).
  28. Brown, L. Y., Dong, W., Kantor, B. An Improved protocol for the production of lentiviral vectors. STAR Protoc. 1 (3), 100152 (2020).
  29. Moce-Llivina, L., Jofre, J., Muniesa, M. Comparison of polyvinylidene fluoride and polyether sulfone membranes in filtering viral suspensions. J Virol Methods. 109 (1), 99-101 (2003).
  30. Jiang, W., et al. An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation. Sci Rep. 5, 13875 (2015).
  31. Czubala, M. A., et al. TGFbeta induces a SAMHD1-independent post-entry restriction to HIV-1 infection of human epithelial langerhans cells. J Invest Dermatol. 136 (10), 1981-1989 (2016).
  32. Bouabe, H., Okkenhaug, K. Gene targeting in mice: a review. Methods Mol Biol. 1064, 315-336 (2013).
  33. Kim, J. M., Rasmussen, J. P., Rudensky, A. Y. Regulatory T cells prevent catastrophic autoimmunity throughout the lifespan of mice. Nat Immunol. 8 (2), 191-197 (2007).
  34. Decalf, J., et al. Sensing of HIV-1 entry triggers a Type I Interferon response in human primary macrophages. J Virol. 91 (15), e00147-e00217 (2017).
  35. Wilson, A. A., et al. Amelioration of emphysema in mice through lentiviral transduction of long-lived pulmonary alveolar macrophages. J Clin Invest. 120 (1), 379-389 (2010).
  36. Markusic, D. M., van Til, N. P., Hiralall, J. K., Elferink, R. P., Seppen, J. Reduction of liver macrophage transduction by pseudotyping lentiviral vectors with a fusion envelope from Autographa californica GP64 and Sendai virus F2 domain. BMC Biotechnol. 9, 85 (2009).
  37. Burke, B., Sumner, S., Maitland, N., Lewis, C. E. Macrophages in gene therapy: cellular delivery vehicles and in vivo targets. J Leukoc Biol. 72 (3), 417-428 (2002).
  38. Bain, C. C., Jenkins, S. J. The biology of serous cavity macrophages. Cell Immunol. 330, 126-135 (2018).
  39. Milone, M. C., O’Doherty, U. Clinical use of lentiviral vectors. Leukemia. 32 (7), 1529-1541 (2018).

Tags

Lentiviral VectorGene ModulationMicroRNA ModulationPeritoneal MacrophagesIn VivoHomeostasisPeritonitisHEK293T CellsSucrose PurificationIntraperitoneal InjectionGene Function

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Gurney, M., Davies, L. C., Jones, R. E., Bart, V. M., Jenkins, R. H., Brennan, P., Taylor, P. R., Czubala, M. A. Lentiviral Vector Preparation for Efficient Gene and MicroRNA Modulation of Peritoneal Cavity Tissue-Resident Macrophages In Vivo in Mice. J. Vis. Exp. (204), e64926, doi:10.3791/64926 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image