JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Kweek van biggendarm 3D-organoïden uit gecryopreserveerde epitheliale crypten en oprichting van celmonolagen

Published: February 10, 2023
doi:
10.3791/64917
, , , , , ,
1GenPhySE,Université de Toulouse, INRAE, ENVT, 2Lallemand Animal Nutrition, 3Institut NuMeCan, INRAE, INSERM,Université de Rennes, 4FG 16: Mycotic and Parasitic Agents and Mycobacteria,Robert Koch-Institute

Summary

Hier beschrijven we een protocol om varkensdarm 3D-organoïden te kweken uit gecryopreserveerde epitheelcrypten. We beschrijven ook een methode om celmonolagen vast te stellen die zijn afgeleid van 3D-organoïden, waardoor toegang wordt verkregen tot de apicale kant van epitheelcellen.

Abstract

Intestinale organoïden worden steeds vaker gebruikt om het darmepitheel te bestuderen voor het modelleren van spijsverteringsziekten, of om interacties met geneesmiddelen, voedingsstoffen, metabolieten, pathogenen en de microbiota te onderzoeken. Methoden om darmorganoïden te kweken zijn nu beschikbaar voor meerdere soorten, waaronder varkens, een soort van groot belang, zowel als landbouwhuisdier als als translationeel model voor mensen, bijvoorbeeld om zoönotische ziekten te bestuderen. Hier geven we een diepgaande beschrijving van een procedure die wordt gebruikt om 3D-organoïden van varkensdarmen te kweken uit bevroren epitheelcrypten. Het protocol beschrijft hoe epitheliale crypten uit de varkensdarm te cryopreserveren en de daaropvolgende procedures om 3D-darmorganoïden te kweken. De belangrijkste voordelen van deze methode zijn (i) de temporele dissociatie van de isolatie van crypten uit de cultuur van 3D-organoïden, (ii) de bereiding van grote voorraden gecryopreserveerde crypten afgeleid van meerdere darmsegmenten en van meerdere dieren tegelijk, en dus (iii) de vermindering van de noodzaak om verse weefsels van levende dieren te bemonsteren. We beschrijven ook een protocol om celmonolagen vast te stellen die zijn afgeleid van 3D-organoïden om toegang te krijgen tot de apicale kant van epitheelcellen, de plaats van interacties met voedingsstoffen, microben of medicijnen. Over het algemeen zijn de hier beschreven protocollen een nuttige bron voor het bestuderen van het darmepitheel van varkens in veterinair en biomedisch onderzoek.

Introduction

Het darmepitheel wordt gevormd door een monolaag van cellen die het spijsverteringsslijmvlies bedekken op het grensvlak met de luminale omgeving. Deze positie wordt geassocieerd met diverse functies, zoals opname van voedingsstoffen en barrièrefunctie, die worden ondersteund door de aanwezigheid van stamcellen en meerdere gedifferentieerde epitheelceltypen (absorberende, entero-endocriene, Paneth- en bokaalcellen)1. Vereeuwigde cellijnen die traditioneel worden gebruikt om epitheelcellen te bestuderen, hebben grote beperkingen, omdat ze niet de cellulaire complexiteit van het darmepitheel weerspiegelen en genomische afwijkingen vertonen2. De ontwikkeling van driedimensionale (3D) organoïden door Sato et al.3 leverde een nieuw model op om het darmepitheel te bestuderen met een verbeterde fysiologische relevantie. Inderdaad, intestinale organoïden zijn afgeleid van niet-getransformeerde stamcellen, zijn samengesteld uit meerdere celtypen en recapituleren de functionaliteit van het darmepitheel. Intestinale organoïden worden steeds vaker gebruikt om de ontwikkeling en functies van het darmepitheel en zijn interacties met pathogenen, voedingsstoffen, toxines, geneesmiddelen, de microbiota en zijn metabolietente begrijpen 2.

Oorspronkelijk ontwikkeld voor mensen en muizen, zijn de methoden die worden gebruikt om darmorganoïden te kweken onlangs aangepast aan andere soorten, waaronder varkens4. Gonzales et al.5 waren de eersten die varkensorganoïden uit het jejunum kweekten; Sindsdien zijn varkensorganoïden beschreven voor andere darmsegmenten (twaalfvingerige darm, ileum en dikke darm)6,7,8 en is aangetoond dat ze een locatiespecifiek fenotype 9,10,11 behouden. Varkensdarm 3D-organoïden worden nu vaak gebruikt om het effect van voedingsstoffen 12,13 of enterische infecties 6,8,14 te bestuderen.

De meeste studies hebben de cultuur van intestinale organoïden beschreven vanaf vers geïsoleerde epitheelcrypten. Dit is echter niet altijd haalbaar om logistieke redenen, met name bij het werken met grote dieren zoals varkens. Inderdaad, dierlijke faciliteiten voor varkens kunnen zich ver van het laboratorium bevinden waar organoïden worden gekweekt, wat de werkorganisatie bemoeilijkt. Bovendien is organoïdecultuur tijdrovend; Het is dus niet praktisch om tegelijkertijd meerdere organoïde lijnen te laten groeien, bijvoorbeeld uit verschillende darmsegmenten of meerdere dieren. Om deze problemen te omzeilen, hebben enkele studies bij mensen, paarden en varkens methoden beschreven om organoïden te kweken uit bevroren darmweefsels (of biopsieën) of uit geïsoleerde epitheliale crypten 4,15,16,17. Deze methoden maken de cryopreservatie van intestinale epitheelstamcellen uit meerdere darmsegmenten van een enkel dier mogelijk, die vervolgens kunnen worden gebruikt om organoïden te laten groeien wanneer dat nodig is. Bovendien maakt dit een sterke vermindering mogelijk van het aantal levende dieren dat als donoren van stamcellen wordt gebruikt, omdat grote voorraden gecryopreserveerde crypten kunnen worden gecreëerd (principes van 3R). Een ander voordeel van deze methode is de groei van intestinale organoïden alleen van dieren van belang na het verkrijgen van fenotypische of genotypische resultaten, wat zeer kosteneffectief is.

In vivo zijn darmepitheelcellen gepolariseerd, waarbij de apicale kant naar het lumen is gericht. In vitro, in 3D-organoïden, is de apicale kant van epitheelcellen ook naar het lumen gericht (d.w.z. in de organoïden)4. Deze organisatie voorkomt toegang tot de apicale kant, wat een probleem is bij het bestuderen van de effecten van luminale componenten (bijv. Voedingsstoffen, microben, metabolieten) op epitheelcellen. Om dit nadeel te omzeilen, zijn verschillende methoden ontwikkeld, zoals de kweek van organoïde cellen als 2D-monolagen, micro-injectie en polariteitsomkering (“apicale organoïden”)18,19. De cultuur van organoïde cel monolagen is in opkomst als het meest efficiënte en handelbare systeem. Het principe is om 3D-organoïden te dissociëren in afzonderlijke cellen en ze te zaaien op een celkweekvat dat eerder is bedekt met een dunne laag extracellulaire matrix (ECM)20. In deze kweekomstandigheden is de apicale kant van de epitheelcellen naar boven gericht en dus toegankelijk voor experimentele behandelingen20. De kweek van organoïde cel monolagen is onlangs aangepast voor de varkensdarm21,22; celmonolagen afgeleid van 3D-organoïden van varkens zijn gebruikt voor meerdere toepassingen, waaronder de studie van enterische infecties 6,23,24,25, het transport van voedingsstoffen9 en spijsverteringsziektemodellering 26.

Hier presenteert deze studie eerst een gedetailleerd protocol voor de kweek en het onderhoud van 3D-organoïden van varkensdarm afgeleid van gecryopreserveerde epitheelcrypten (figuur 1). Vervolgens wordt een protocol beschreven om celmonolagen vast te stellen uit 3D-organoïden van varkensdarmen. De hier beschreven methoden bieden experimentele hulpmiddelen die kunnen worden gebruikt om het darmepitheel van varkens te bestuderen voor nutriëntentransport, barrièrefunctie en gastheer-micro-organisme interacties.

Protocol

Dit protocol werd goedgekeurd door de lokale ethische commissie (N°TOXCOM/0136/PP) in overeenstemming met de Europese richtlijn inzake de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt (2010/63/EU). Dit protocol wordt beschreven voor het jejunum als voorbeeld, maar het kan worden gebruikt voor elk segment van de dunne en dikke darm (twaalfvingerige darm, jejunum, ileum, dikke darm). 1. Isolatie van epitheliale crypten uit de darm van de big OPMERKING: Maak een voorraad van complete Dulbecco’s gemodificeerde adelaarsmedium (DMEMc) met DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine (P / S). Bereid 50 ml aliquots en bewaar ze bij 4 °C gedurende 1 maand. Voorbereiding van oplossingen (te doen op de dag van de crypte-isolatie)Bereid de dissociatieoplossing met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), 3 mM dithiothreitol (DTT), 9 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), 10 μM Y27632 ROCK-remmer en 1% penicilline-streptomycine (P / S) en bewaar op ijs. Bereid de vriesoplossing met DMEMc, 10% FBS, 10% dimethylsulfoxide (DMSO) en 10 μM Y27632 ROCK-remmer en bewaar op ijs (de uiteindelijke FBS-concentratie is 18%). Bereid de transportoplossing met koude PBS aangevuld met 1% P/S en bewaar deze op ijs. Isolatie van epitheliale cryptenSlacht een big door elektronarcose gevolgd door exsanguinatie. Open onmiddellijk na het slachten de buik van de big met een scalpel en verwijder de hele darm. Verzamel ongeveer 2 cm van een darmsegment en bewaar het in een koude transportoplossing. Houd het segment op ijs totdat de crypte is geïsoleerd (tot 2 uur). Leg het weefsel in een petrischaaltje. Open het darmsegment in de lengterichting en was het weefsel voorzichtig in koude PBS aangevuld met 1% P / S om de darminhoud te verwijderen. Breng het weefsel over in een nieuwe petrischaal gevuld met 10 ml koude PBS aangevuld met 1% P / S. Houd het weefsel vast met een pincet en verwijder de villi en het resterende slijm door te schrapen met een microscoopglaasje.OPMERKING: De verwijdering van de villi (de tongvormige structuur) kan worden gecontroleerd door microscopische observatie van het supernatant. Breng het weefsel over in een conische buis van 15 ml met 5 ml ijskoude dissociatieoplossing en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) op een roterende schudder (15 tpm). Breng het weefsel over in een nieuwe petrischaal en voeg 10 ml koude PBS toe, aangevuld met 1% P / S. Isoleer de crypten mechanisch door het slijmvlies stevig te schrapen met een microscoopglaasje.OPMERKING: Controleer onder een microscoop de aanwezigheid van epitheelcrypten in PBS (figuur 2A). Zuig de crypteoplossing aan met een serologische pipet en filtreer door een celzeef van 100 μm in een conische buis van 50 ml. Pipetteer 10 μL van de oplossing en controleer de aanwezigheid van crypten onder een microscoop. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi onder een steriele bioveiligheidskast het supernatant weg en resuspensie de pellet van crypten in 10 ml koude DMEMc aangevuld met 10 μM Y27632 ROCK-remmer. Pipetteer 10 μL van de crypteoplossing in een plaat met 48 putten. Tel handmatig het aantal crypten onder een microscoop met een vergroting van 10x en bereken de concentratie van crypten per ml oplossing.OPMERKING: De geïsoleerde crypten kunnen direct worden gebruikt om darmorganoïden te kweken. Het is echter vaak handiger om een grote partij crypten van elke big te cryopreserveren en ze later te gebruiken voor organoïde cultuur. Bevriezing van epitheelcryptenBreng een volume overeen dat overeenkomt met 900 crypten over in een conische buis van 15 ml. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en suspensie de pellet van crypten in 1 ml van de vriesoplossing. Breng over in een cryobuis en plaats de injectieflacon in een celvriescontainer. Bewaar de celvriescontainer gedurende 24 uur bij -80 °C en breng de injectieflacons vervolgens over in vloeibare stikstof voor langdurige opslag. 2. Oprichting van biggen intestinale 3D-organoïden uit bevroren epitheelcrypten OPMERKING: Biggen intestinale 3D-organoïden worden gekweekt in een commercieel kweekmedium dat is geformuleerd voor de groei van menselijke organoïden, aangevuld met 1% P / S en 100 μg / ml van een antimicrobieel middel voor primaire cellen, en bewaard bij 4 ° C gedurende maximaal 1 week. Een tumor-afgeleide extracellulaire matrix (ECM) wordt gebruikt voor de kweek van 3D-organoïden. Alle referenties van commerciële producten worden gepresenteerd in de Materiaaltabel. Voorbereiding van materialenPlaats de pipetpunten op -20 °C (minstens een nacht). Breng de bevroren aliquots van de ECU (500 μL) ten minste 1 uur van tevoren op 4 °C. Verwarm een plaat met 48 putten voor in een 37 °C, 5% CO 2-incubator. Plaats het kweekmedium bij RT. Verwarm een waterbad voor op 37 °C. Plaats een kleine ijsemmer onder de motorkap onder aseptische omstandigheden. Ontdooien van bevroren epitheliale cryptenOntdooi snel een injectieflacon met 900 bevroren crypten in een waterbad bij 37 °C (minder dan 5 min). Breng de crypteoplossing over in een conische buis van 15 ml. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten bij RT. Verwijder het supernatant Voeg 150 μL van de ECU met gekoelde tips toe om een eindconcentratie van 150 crypten per 25 μL ECM te verkrijgen. Pipetteer 10 keer op en neer om een homogene suspensie van crypten in de ECU te verkrijgen.OPMERKING: Houd de ECU altijd op ijs om polymerisatie te voorkomen. Gebruik altijd voorgekoelde pipetpunten bij -20 °C om de ECU te manipuleren. Pipetteer langzaam om te voorkomen dat er luchtbellen in de ECU ontstaan. Bij deze stap wordt een onverdunde ECU gebruikt om te voorkomen dat de kleine druppels instorten. Zaai zes putjes met een druppel van 25 μL per put met afgekoelde tips in een voorverwarmde plaat met 48 putten.OPMERKING: Houd de punt verticaal, in het midden van de put, en pipetteer langzaam zonder lucht te introduceren om een koepel te verkrijgen. Hier worden 48-putplaten gebruikt, omdat het organoïdenaantal meestal laag is wanneer het begint met bevroren crypten. Incubeer gedurende 30 minuten in een 37 °C, 5% CO 2-incubator voor polymerisatie van de ECM. Voeg 250 μL per putje kweekmedium toe bij RT. Incubeer in een 37 °C, 5% CO 2-incubator en verander het kweekmedium om de2-3 dagenOPMERKING: De crypten zijn meestal niet zichtbaar na de ontdooiprocedure en de meeste cellen zijn gedissocieerd in de ECU (figuur 2B). 3. Passage van biggen intestinale 3D-organoïden afgeleid van bevroren crypten OPMERKING: De tijd om organoïden uit bevroren crypten te verkrijgen is meestal langer dan wanneer u begint met verse crypten. Organoïden zijn meestal klaar om 10 dagen na het ontdooien te splitsen (figuur 2B). Voorbereiding van materialenBreng de bevroren aliquots van de ECU (500 μL) gedurende ten minste 1 uur op 4 °C. Verwarm de 24-putplaten voor op 37 °C. Verwarm de PBS en het enzymdissociatiereagens aangevuld met 10 μM Y27632 ROCK-remmer voor in een waterbad bij 37 °C. Plaats het kweekmedium bij RT. Plaats een kleine ijsemmer onder de motorkap onder aseptische omstandigheden. Doorgang van 3D-organoïden afgeleid van bevroren cryptenVerwijder de kweekmedia en was met 250 μL voorverwarmd PBS bij 37 °C. Voeg in elk putje 250 μL voorverwarmd enzymdissociatiereagens aangevuld met 10 μM Y27632 ROCK-remmer bij 37 °C toe.OPMERKING: Vanwege het lage aantal organoïden wordt de dissociatie van organoïden direct in elke put uitgevoerd. Maak de organoïden in de ECU los door te schrapen met een P1000-pipet en homogeniseer voorzichtig door vijf keer te pipetteren. Incubeer gedurende 5 minuten in een 37 °C, 5% CO2 incubator. Dissocieer de cellen door 10 keer op en neer te pipetteren met behulp van een P1000-pipet.OPMERKING: Het doel is om geïsoleerde cellen of kleine celclusters (<10 cellen) te verkrijgen. Controleer de dissociatie onder een microscoop. Als er nog steeds grote fragmenten van organoïden worden waargenomen, herhaalt u stap 3.2.4. Voeg 500 μL DMEMc toe in elke put met gedissocieerde cellen en pool tot 12 putjes in een conische buis van 15 ml met 3 ml koude DMEMc. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en resuspensie van de pellet in 1 ml koude DMEMc. Tel de cellen met een verdunning van 1:2 in Trypan blauw met een celteller.OPMERKING: De geautomatiseerde celteller kan de cellen binnen kleine clusters tellen, indien aanwezig. Centrifugeer het benodigde volume van de celoplossing om 3.000 levende cellen per koepel te hebben (één koepel per put van de 24-putplaat) bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Resuspendeer de cellen met 17 μL koude DMEMc per 3.000 levende cellen op ijs. Pas het volume aan op het vereiste aantal putjes. Voeg langzaam 33 μL koude ECU met gekoelde punten per 3.000 levende cellen toe en homogeniseer op ijs zonder bubbels te maken. Pas het volume aan op het vereiste aantal putjes.OPMERKING: De cellen worden geresuspendeerd in een oplossing die 1/3 DMEMc en 2/3 ECU bevat. Voor elke koepel is 50 μL van deze oplossing nodig. Verdunde ECM is goedkoper en gemakkelijker te pipetteren. Zaai de putjes in met 50 μL van de ECM-cel suspensie per put met afgekoelde tips in een voorverwarmde 24-putplaat. Incubeer gedurende 30 minuten in een 37 °C, 5% CO 2-incubator voor polymerisatie van de ECM. Voeg 500 μL van het kweekmedium per put toe. Incubeer in een 37 °C, 5% CO 2 incubator en verander het kweekmedium om de2-3 dagenOPMERKING: De organoïden kunnen direct worden gebruikt voor i) experimenten, ii) onderhoud van de 3D-organoïdecultuur, iii) bevriezing of iv) zaaien van de organoïde celmonolagen (figuur 1). Controleer de groei van de organoïden elke dag met een microscoop om de optimale timing te kiezen voor het splitsen van de organoïden. De organoïden moeten een helder en leeg lumen en goed gedefinieerde randen hebben. Volwassen organoïden met zwart puin in het lumen mogen niet worden gebruikt voor splitsing (figuur 3). 4. Onderhoud van organoïde cultuur in 3D OPMERKING: Voor het passeren moeten organoïden er helder uitzien met een leeg lumen. Zwart puin verschijnt ongeveer 5 dagen na het splitsen in het lumen en duidt op de aanwezigheid van dode cellen. Het beperken van het aantal dode cellen op het moment van passeren heeft de voorkeur voor een optimaal onderhoud van de cultuur. Het schema moet dus worden aangepast om te voorkomen dat dit stadium van volwassenheid wordt bereikt. Voorbereiding van materiaalBreng de aliquots van de ECU (500 μL) op 4 °C om gedurende ten minste 1 uur te ontdooien. Verwarm een plaat met 24 putten voor op 37 °C. Verwarm het enzymdissociatiereagens aangevuld met 10 μM Y27632 ROCK-remmer voor in een waterbad bij 37 °C. Plaats het kweekmedium bij RT. Plaats een kleine ijsemmer onder de motorkap onder aseptische omstandigheden. Passage van intestinale 3D-organoïdenMaak de organoïden los met de ECU door te schrapen met een P1000-pipet. Homogeniseer voorzichtig door pipetteren in het kweekmedium en breng over in een conische buis van 15 ml met 5 ml koude DMEMc op ijs.OPMERKING: Een conische buis van 15 ml is vereist voor een zwembad met 12 putten van organoïden gekweekt in koepels van 50 μL in 24-putplaten. Centrifugeer de verzamelde organoïden bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.OPMERKING: De organoïden vormen een witte pellet aan de onderkant van de buis. Als de organoïden na centrifugeren nog steeds in de suspensie in de ECU zitten, zuig dan voorzichtig het bovenste supernatant op (zonder de ECM-laag aan te raken), homogeniseer door 10 keer te pipetteren met een P1000-pipet en herhaal de centrifugatiestap. De ECM-laag mag na deze procedure niet zichtbaar zijn. Zuig het supernatant voorzichtig op en resuspensie de celpellet in 1 ml voorverwarmd enzymdissociatiereagens aangevuld met 10 μM Y27632 ROCK-remmer. Pipet 10 keer op en neer om dissociatie van de organoïden te initiëren. Incubeer gedurende 5 minuten in een waterbad van 37 °C voor enzymatische vertering. Verstoor de organoïden mechanisch door 10 keer te pipetteren met een P1000-pipet. Controleer de celsuspensie onder de microscoop.OPMERKING: Het doel is om geïsoleerde cellen of kleine celclusters te verkrijgen. Als er nog steeds grote organoïde fragmenten worden waargenomen, herhaalt u de incubatie (stap 4.2.4) en de mechanische verstoring (stap 4.2.5). Voeg 4 ml ijskoude DMEMc toe. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C Gooi het supernatant weg en resuspensie van de organoïde celkorrel in 1 ml DMEMc. Ga te werk zoals hierboven beschreven (stappen 3.2.7 tot en met 3.2.13) om de cellen te tellen en de organoïde cellen te zaaien in 50 μL ECM-koepels met 3000 levende cellen in voorverwarmde 24-putplaten. 5. Invriezen van 3D-organoïden Bereid het benodigde volume (1 ml voor een pool van twee koepels) vriesoplossing met DMEMc aangevuld met 10% FBS, 10% DMSO en 10 μM Y27632 ROCK-remmer en bewaar op ijs (de uiteindelijke FBS-concentratie is 18%). Verwijder het kweekmedium uit de in te vriezen putjes. Voeg 1 ml van de vriesoplossing toe aan de eerste put die moet worden ingevroren, maak de ECU los door te schrapen en homogeniseer met de pipetpunt. Breng de organoïde suspensie over van de eerste put naar de tweede put om te worden ingevroren. Breng de pool van de twee putjes over naar een cryobuis en plaats de injectieflacon in een celvriescontainer. Bewaar de celvriescontainer gedurende 24 uur bij -80 °C en breng de injectieflacons vervolgens over in vloeibare stikstof voor langdurige opslag. 6. Kweek van celmonolagen afgeleid van 3D-organoïden OPMERKING: Monolagen van varkensorganoïde cellen worden gekweekt in een 2D-medium dat bestaat uit het kweekmedium dat wordt gebruikt voor 3D-organoïden aangevuld met 20% FBS. Voorbereiding van materialenBereid het 2D-medium voor en houd het bij RT. Verwarm het enzymdissociatiereagens aangevuld met 10 μM Y27632 ROCK-remmer voor in een waterbad bij 37 °C. Coating van de kweekinzetSteriliseer een pincet en breng ze over naar de bioveiligheidskast. Plaats de celkweekinzetstukken (0,33 cm2) met het pincet in een 24-putsplaat. Bereid de coatingoplossing met collageen IV verdund bij 50 μg/ml in koude PBS. Pipet op en neer om te mengen Voeg 150 μL van de verdunde collageen IV-oplossing toe aan elke celkweekinzet, wat overeenkomt met 22,7 μg/cm2.OPMERKING: Oriënteer het pipet voorzichtig verticaal in het midden van het permeabele membraan en controleer of de collageenoplossing het hele membraan bedekt. Plaats de plaat in een 37 °C, 5% CO2 incubator en laat een nacht (of minimaal 3 uur) staan. Zaaien van 3D-organoïde cellen in celkweekinzetstukkenBereid een celsuspensie voor van de 3D-organoïden, zoals beschreven in de stappen 4.2.1 tot en met 4.2.7. Tel de cellen met een verdunning van 1:2 in Trypan blauw met een celteller en bereken het benodigde volume om 2,5 x 105 cellen per kweekinzet te zaaien, overeenkomend met 7,6 x 105 cellen/cm2. Centrifugeer het benodigde volume van de celsuspensie bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Zuig tijdens het centrifugeren voorzichtig de coatingoplossing uit de kweekinzetstukken en laat 5 minuten drogen bij RT onder de motorkap zonder deksel. Gooi na centrifugatie het supernatant weg en resuspensie de celpellet in het benodigde volume 2D-medium aangevuld met 10 μM Y27632 ROCK-remmer. Voor elke insert is een volume van 200 μL 2D-medium met de cellen nodig. Zaai 200 μL van de celsuspensie (2,5 x 105 cellen) op het gecoate permeabele membraan (apicale zijde) (figuur 4A).OPMERKING: Pipet langzaam in het midden van het membraan en houd de punt verticaal. Voeg 500 μL van het 2D-medium aangevuld met 10 μM Y27632 ROCK-remmer toe aan het onderste compartiment (basale zijde). Incubeer in een 37 °C, 5% CO2 incubator. Vervang een dag na het zaaien de apicale en basale media door vers 2D-medium zonder de Y27632 ROCK-remmer. Verander het 2D-medium elke dag. De monolaag wordt 1 dag na het zaaien confluent en kan dan worden gebruikt voor experimenten.OPMERKING: Een transepitheliale elektrische weerstand (TEER) boven de blanco (insert zonder cellen) bevestigt dat confluentie is bereikt (figuur 4B). 7. Immunostaining van organoïde cel monolagen Bereiding van oplossingenOPMERKING: Pas het volume van de oplossingen aan op basis van het aantal te kleuren putten; 200 μL van de oplossing is vereist bij elke stap voor één put. Verwijzingen naar alle commerciële producten zijn opgenomen in de tabel met materialen.Bereid een 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing onder een chemische kap door 5 ml 32% PFA toe te voegen aan 35 ml PBS. Bereid 10 ml aliquots en bewaar bij -20 °C.LET OP: Manipuleer de PFA altijd onder de chemische kap, terwijl u nitrilhandschoenen draagt. Bereid een oplossing van 0,2% Triton X100-PBS door onmiddellijk voor gebruik 2 μL Triton X100 toe te voegen aan 1 ml PBS. Blijf bij RT. Bereid een 10% runderserumalbumine (BSA)-PBS-oplossing door 100 mg BSA toe te voegen aan 1 ml PBS. Blijf bij RT. Bereid een 1% BSA-PBS-oplossing door 10 mg BSA toe te voegen aan 1 ml PBS. Blijf bij RT. Bereid een oplossing van het occludine primaire antilichaam verdund bij 1:200 door toevoeging van 5 μL primair antilichaam aan 995 μL 1% PBS BSA. Bewaar de oplossing op ijs. Bereid een oplossing van het secundaire antilichaam verdund tot 1:1.000 door 1 μL secundair antilichaam toe te voegen aan 999 μL 1% BSA-PBS. Bewaar de oplossing op ijs, beschermd tegen licht. Bereid een oplossing van falloidine TRITC bij 10 μg/ml door 10 μL TRITC bij 1 mg/ml toe te voegen aan 990 μL PBS. Op ijs houden, beschermd tegen licht. ImmunostainingOPMERKING: Tenzij anders aangegeven, worden alle incubaties uitgevoerd bij RT, onder langzame agitatie op een schommelplatform (30 tpm). De immunokleuring wordt direct in de celkweekinzet uitgevoerd.Verwijder het basale en apicale medium. Plaats de plaat onder de chemische kap. Was de monolagen tweemaal met 200 μL PBS bij RT en incubeer gedurende 5 min. Bevestig de celmonolagen met 200 μL 4% PFA bij RT en incubeer gedurende 20 minuten bij RT. Was de monolagen tweemaal met 200 μL PBS bij RT en incubeer gedurende 5 min.OPMERKING: Na de fixatie- en wasstappen kan de monolaag gedurende 1 week in PBS op 4 °C worden bewaard. Verwijder de PBS, permeabiliseer met 200 μL van 0,2% Triton X100-PBS en incubeer gedurende 20 minuten. Was de monolagen tweemaal met 200 μL PBS bij RT en incubeer gedurende 5 min. Voeg 200 μL primaire antilichaamoplossing toe in 1% BSA-PBS en incubeer ‘s nachts bij 4 °C, onder langzaam roeren op een schommelplatform. Neem een negatieve controleput op door slechts 1% BSA-PBS toe te voegen zonder het primaire antilichaam. Was de monolagen drie keer met 200 μL PBS bij RT en incubeer gedurende 5 min. Voeg 200 μL secundair antilichaam toe in 1% BSA-PBS en incubeer gedurende 2 uur bij RT, beschermd tegen het licht. Was de monolagen drie keer met 200 μL PBS bij RT en incubeer gedurende 5 min. Voeg 200 μL falloidine TRITC toe bij 10 μg/ml en incubeer gedurende 10 minuten. Was de monolagen tweemaal met 200 μL PBS bij RT en incubeer gedurende 5 min. Verwijder de PBS en snijd het membraan af met een scalpel. Herstel het membraan met een pincet en plaats het op een microscoopglaasje, met de apicale kant naar boven gericht. Voeg 15 μL van het montagemedium aangevuld met DAPI op 1:1.000 direct op het membraan toe. Plaats een coverslip en seal. Bewaren bij 4 °C, beschermd tegen licht, tot beeldvorming.

Representative Results

Volgens het hierboven beschreven protocol worden epitheliale crypten verkregen uit de varkensdarm en gecryopreserveerd voor langdurige opslag in vloeibare stikstof (figuur 1 en figuur 2A). Na het ontdooien worden de cryptestamcellen in de ECU gezaaid (figuur 2B). De crypt-structuur gaat meestal verloren na deze stap, als gevolg van het uiteenvallen van de crypt-structuur in de ECM. De organoïden kunnen binnen 3-4 dagen worden waargenomen en groeien dan snel en ontwikkelen ontluikende structuren (figuur 2B). We hebben met succes organoïden verkregen na het ontdooien van bevroren crypten in >80% van de pogingen. Ongeveer 10 dagen na het ontdooien (volgens de groeisnelheid van organoïden) wordt een passage van organoïden uitgevoerd om de cultuur uit te breiden (figuur 3). De organoïden groeien sneller na het splitsen en ze presenteren verschillende morfologieën, met sommige cystische en een meerderheid van ontluikende organoïden. Voor een optimaal onderhoud van de cultuur moeten de organoïden die worden gebruikt voor het passeren een helder en leeg lumen en goed gedefinieerde randen hebben (voorbeelden aangegeven met groene pijlen) zonder zwart puin in het lumen (aangegeven door rode pijlen), zoals waargenomen bij volwassen organoïden (figuur 3). We ontdekten dat zwart celafval zich begint op te hopen rond dag 6 na het passeren. Daarom wordt het splitsen of bevriezen van de organoïden op dag 4-5 na het passeren aanbevolen. De volwassenheidsfase van de organoïden is ook een belangrijk punt bij het verkrijgen van celmonolagen. Organoïden met gevorderde rijpheid (aangegeven door de aanwezigheid van zwarte celresten in het lumen) zijn niet optimaal om monolagen te zaaien. We dissociëren 3D-organoïden meestal 4 dagen na passage om cellen te verzamelen voor 2D-cultuur. Ongeveer één tot drie putjes van 3D-organoïden gekweekt op 3.000 cellen per 50 μL koepel van de ECM zijn nodig voor het zaaien van één kweekinzet met 2,5 x 105 cellen. Cellen hechten zich en vormen binnen 1 dag een volledig confluente monolaag (figuur 4A), wat wordt bevestigd door de hoge TEER van ongeveer 700 Ω·cm2 (figuur 4B). De celranden zijn echter moeilijk te visualiseren door brightfieldmicroscopie op dit vroege tijdstip, waarschijnlijk vanwege een laag differentiatieniveau. De TEER blijft 3 dagen hoog (figuur 4B). Actinekleuring geeft aan dat de apicale kant van de epitheelcellen is gericht op het lumen in 3D-organoïden (figuur 5A). Organoïde cellen gezaaid in cultuur insert vormen een confluente enkele laag epitheelcellen, met de apicale kant gericht op het bovenste compartiment (figuur 4B,C). Occludinkleuring onthult de aanwezigheid van tight junctions aan de apicale zijde van de epitheelcellen in 3D-organoïden en in celmonolagen (figuur 5A-C). Figuur 1: Schematische weergave van de methoden die worden gebruikt om 3D-organoïden en celmonolagen afgeleid van organoïden te kweken. Epitheelcrypten worden geïsoleerd uit de darm van de biggetje. Deze crypten kunnen i) onmiddellijk worden gebruikt om 3D-organoïden te kweken of ii) worden ingevroren en opgeslagen in een biobank in vloeibare stikstof. Gecryopreserveerde crypten kunnen worden ontdooid en gebruikt om 3D-organoïden te kweken. De 3D-organoïdecultuur kan worden onderhouden met opeenvolgende splitsingen, of worden ingevroren en opgeslagen in de biobank. Celmonolagen kunnen worden verkregen uit de 3D-organoïdecultuur om toegang te krijgen tot de apicale kant van de cellen en de epitheliale barrièrefunctie te bestuderen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Kweek van varkensdarm 3D organoïden uit gecryopreserveerde epitheelcrypten. (A) Representatief microscopisch beeld van vers geïsoleerde jejunale crypten. (B) Representatieve microscopische beelden van 3D-organoïden verkregen na het ontdooien van de jejunale crypten. De organoïden werden gekweekt in een 25 μL koepel van ECM in een 48-well plaat. De figuur toont afbeeldingen van de 3D-organoïden op 4, 7, 8, 9 en 10 dagen na het zaaien. De schaalbalk vertegenwoordigt 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Morfologie van varkensdarm 3D-organoïden afgeleid van gecryopreserveerde epitheelcrypten na de eerste passage. Representatieve microscopische beelden van de ontwikkeling van organoïden afgeleid van gecryopreserveerde jejunumcrypten na de eerste passage van dag 4 naar dag 7. Groene pijlen geven duidelijke organoïden aan die geschikt zijn voor de passage of het zaaien van monolagen. Rode pijlen geven volwassen organoïden aan die niet geschikt zijn voor het splitsen of zaaien van monolagen; Putten moeten dus worden gebruikt vóór de verschijning van deze morfologie. De schaalbalk vertegenwoordigt 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Kenmerken van cel monolagen afgeleid van varkens intestinale 3D organoïden . (A) Representatieve microscopische beelden van de monolaag morfologie gedurende 3 dagen. Jejunum organoïde cellen werden gezaaid op 2,5 x 105 cellen in 0,33 cm2 celcultuur inserts bedekt met collageen IV bij 50 ng / ml. De schaalbalk vertegenwoordigt 500 μm. (B) Transepitheliale elektrische weerstand (TEER) van organoïde cel monolagen gedurende 3 dagen. Stippen verbonden door een lijn corresponderen met dezelfde put op verschillende tijdstippen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Beeldvorming van varkensjejunum organoïden gekweekt in 3D of 2D. Confocale microscopie beeldvorming van (A) 3D organoïden 5 dagen na splitsing en (B,C) organoïde cel monolagen 3 dagen na het zaaien (B: XZ sectie; C: XY sectie). DNA (blauw) was gekleurd met DAPI. Actine (rood) was gekleurd met falloidine. Occludin (groen) was gekleurd met een polyklonaal antilichaam. Witte pijlen geven occludin aan dat gelokaliseerd is op de tight junction. De schaalbalk vertegenwoordigt 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Dit protocol beschrijft een methode die wordt gebruikt om epitheliale crypten uit de darm van de big te cryopreserveren voor de langdurige opslag en daaropvolgende kweek van 3D-organoïden. Dit protocol maakt gebruik van een vriesoplossing die DMSO, FBS, de Y27632 ROCK-remmer, DMEM en antibiotica bevat. Een andere studie bij varkens verkregen organoïden uit crypten gecryopreserveerd in een vergelijkbare vriesoplossing, maar zonder de ROCK-remmer15. De Y27632 ROCK-remmer werd opgenomen om apoptose te voorkomen en de stamcelpool te behouden, omdat na het ontdooien epitheelcryptecellen worden gedissocieerd, wat kan leiden tot celdood (‘anoikis’)27,28. Interessant is dat paardenenteroïden zijn verkregen uit epitheliale crypten die zijn bevroren in een kweekmedium dat alleen DMEM en DMSO16 bevat; Deze eenvoudige methode is nog niet getest voor varkensepitheelcrypten. Andere methoden zijn gepubliceerd om menselijke en varkensorganoïden te kweken uit bevroren weefsels of biopsieën in plaats van epitheliale crypten 4,17. Het voordeel van deze methode is de mogelijkheid om de darmweefsels direct te cryopreserveren zonder de crypte-isolatieprocedure uit te voeren, wat tijd en laboratoriumapparatuur vereist. Dit kan handig zijn wanneer de weefsels ver van het laboratorium moeten worden verzameld. Bij het isoleren van de crypten onmiddellijk na het slachten kunnen echter grote delen van de darm worden verwerkt om een zeer groot aantal crypten te verkrijgen, wat niet het geval is wanneer wordt uitgegaan van kleine bevroren weefselfragmenten. Na het ontdooien van epitheliale crypten werden organoïden waargenomen van 3-4 dagen na het zaaien en na 10 dagen gesplitst. Dit is een langzamere groeisnelheid dan bij het starten van de kweek uit verse epitheelcrypten, waarvoor de organoïden werden verkregen vanaf dag 1 na het zaaien, en kunnen meestal worden gesplitst rond dag 511. Khalil et al. rapporteerden ook een vertraagde groei van varkensenteroïden bij het starten van bevroren crypten15, wat suggereert dat stamcellen tijd nodig hebben om hun proliferatieve capaciteit te herstellen. We verkregen ook een lager aantal organoïden bij het starten van bevroren crypten in vergelijking met verse crypten, wat te wijten kan zijn aan de dood van stamcellen tijdens het vriesproces. In sommige pogingen om crypten te ontdooien (<20%), verkregen we geen organoïden uit bevroren crypten, waarschijnlijk als gevolg van een suboptimale cryopreservatieprocedure (bijv. Vertraagde bevriezing na crypte-isolatie van waarschijnlijk meer dan 1 uur). Daarom raden we aan om de crypten op ijs te houden totdat ze worden geteld en ze zo snel mogelijk in te vriezen.

Voor 3D-organoïden hebben we ervoor gekozen om een commercieel organoïde kweekmedium te gebruiken dat voor mensen is geformuleerd. Inderdaad, eerdere rapporten hebben aangetoond dat varkensdarmorganoïden efficiënt groeien met dit medium 8,11,14,19,25,26,29,30. Het is van belang dat dit kweekmedium gebruiksklaar is en een gestandaardiseerde concentratie van groeifactoren binnen een batch heeft. Dit kweekmedium is echter duur, de samenstelling ervan is niet bekendgemaakt en het is dus niet mogelijk om de samenstelling ervan te moduleren. Andere studies hebben daarentegen varkensdarmorganoïden gekweekt in aangepaste media die farmacologische remmers, recombinante groeifactor en / of geconditioneerde mediabevatten 5,6,7,21. Hoewel zeer flexibel en goedkoper, is deze methode tijdrovend voor de productie van geconditioneerde media en kan deze niet reproduceerbaar zijn vanwege mogelijke variabiliteit in de concentratie van groeifactoren in geconditioneerde media. De kwaliteit van elke partij geconditioneerde media moet dus worden gevalideerd door organoïdegroei of markergenexpressiete meten 31.

Een studie heeft aangetoond dat jejunale organoïden gekweekt in hetzelfde commerciële organoïde cultuurmedium dat hier wordt gebruikt, sneller groeiden en minder gedifferentieerd leken, vergeleken met enteroïden gekweekt met media die recombinante groeifactor en / of geconditioneerde media bevatten23. Een hoge proliferatieve toestand vergemakkelijkt de kweek van 3D-organoïden, maar kan differentiatie vereisen om meer representatief te zijn voor intestinale fysiologische kenmerken. In dit protocol, voor de passage van 3D-organoïden, zijn de cellen volledig gedissocieerd voor het tellen, waardoor het aantal cellen dat in ECM is gezaaid, kan worden geregeld. Dit verhoogt de reproduceerbaarheid van het fenotype van organoïden, dat sterk wordt beïnvloed door hun dichtheid. Bovendien voorkomt het tellen van de cellen dat er een te lage of overvolle cultuur ontstaat, wat een aanpassing van het kweekschema vereist. De meeste andere studies bereidden organoïde fragmenten voor die niet volledig gedissocieerd waren tot enkele cellen en gebruikten een verdunningsverhouding voor passaging. Deze methode is eenvoudiger, maar kan variabiliteit veroorzaken volgens de organoïde dichtheid van de cultuur.

Voor de cultuur in monolagen worden organoïde cellen gezaaid in kweekinzetstukken die zijn voorgecoat met een dunne laag ECM, die de aanhechting van cellen mogelijk maakt, maar de groei van organoïden in 3D vermijdt. Dit protocol gebruikte collageen type IV als een ECM-eiwit, zoals eerder beschreven bij varkens23. Andere studies met varkensorganoïde monolagen gebruikten dezelfde tumor-afgeleide ECM die hier wordt gebruikt om 3D-organoïdente kweken 6,8,9,21,25,30. Het voordeel van het gebruik van collageen is het vermogen om de eiwitconcentratie te standaardiseren met een volledig gedefinieerde samenstelling, wat niet het geval is in de tumor-afgeleide ECM. Een cruciale stap voor het succes van de cultuur van celmonolagen is om aandacht te besteden aan het visuele uiterlijk van de voorloper 3D-organoïden, die goed gedefinieerde randen en een leeg lumen zonder zwart puin moeten hebben. Inderdaad, organoïden met een hoog rijpingsniveau en een lage proliferatieve snelheid zijn geen geschikte bron van cellen voor 2D-cultuur. De timing van de dissociatie van 3D-organoïden in afzonderlijke cellen is dus cruciaal voor het succes van deze stap.

De cultuur van 2D-monolagen uit afzonderlijke cellen maakt het mogelijk om het aantal gezaaide cellen te standaardiseren, wat moeilijker is wanneer wordt gestart met organoïde fragmenten, zoals uitgevoerd in sommige andere methoden. We zaaiden 7,6 x 10 5 cellen per cm 2, wat hoog is in vergelijking met de meeste andere studies 21,22,23 bij varkens die een lagere celdichtheid gebruikten, variërend van 0,25 x 10 5 cellen per cm 2 tot 1,78 x 10 5 cellen per cm2. De vereiste van een groot aantal organoïde cellen vormt een beperking van dit protocol, maar het stelde ons in staat om snel een confluente monolaag te verkrijgen, die de kweekinzet na 1 dag volledig bedekte. Vermeire et al.23 daarentegen verkregen confluentie na 4-7 dagen met een lagere dichtheid van gezaaide cellen (van 0,25 x 10 5 cellen/cm 2 tot 0,4 x 105 cellen/cm2). Sommige studies hebben ook varkensorganoïde cel monolagen gebruikt die het kweekoppervlak niet volledig bedekten voor infecties met virussen 8,30. In deze omstandigheden is de apicale kant van epitheelcellen toegankelijk voor behandelingen, maar volledig confluente monolagen zijn vereist als het doel is om de opname van voedingsstoffen of epitheliale permeabiliteit te bestuderen.

Voor organoïde cel monolagen werd een commercieel organoïde kweekmedium aangevuld met 20% FBS gebruikt, gebaseerd op een recente studie over van runderen afgeleide monolagen van enteroïden32. In onze tests was de suppletie met 20% FBS nodig om volledig confluente monolagen te verkrijgen, waarschijnlijk vanwege een hoge groeifactorvereiste. Integendeel, andere studies die hetzelfde commerciële medium gebruiken, hebben monolagen vastgesteld zonder extra FBS 8,25,30, maar zonder volledige confluentie te bereiken. Andere studies hebben ook suppletie met 20% FBS gebruikt in een aangepast medium voor de kweek van varkensorganoïde cel monolagen21,22. In onze experimenten is TEER 1 dag na het zaaien hoog (ongeveer 700 Ω · cm 2) en blijft hoog tot dag 3 (ongeveer 1.500 Ω · cm2; dit komt overeen met de vorming van tight junctions, zoals aangegeven door de uitdrukking van occludine. Van der Hee et al. verkregen vergelijkbare TEER-waarden gedurende 72 uur voor jejunum organoïde cel monolagen21. Ze toonden ook aan dat monolagen kunnen worden gehandhaafd tot dag 12-15 met dagelijkse mediaveranderingen. Andere studies hebben daarentegen veel lagere TEER-waarden (ongeveer 200 Ω ·cm2) gemeld voor monolagen van varkensorganoïde cellen 6,22. Deze verschillen tussen studies kunnen verband houden met het bestudeerde darmsegment of met de gebruikte media die de epitheliale differentiatie beïnvloeden.

Kortom, het bovenstaande protocol om 3D-organoïden van varkensdarmen te laten groeien uit bevroren epitheelcrypten vergemakkelijkt de organisatie van het kweekwerk. Het vermindert de behoefte aan vers weefsel dat moet worden verkregen van levende dieren. We leggen ook uit hoe je in minder dan 3 dagen volledig confluente celmonolagen kunt vaststellen die zijn afgeleid van varkensorganoïden. Onze protocollen kunnen dus nuttige bronnen zijn voor wetenschappers die het darmepitheel van varkens bestuderen voor veterinair of biomedisch onderzoek.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door Institut Carnot France Futur Elevage (“OrganoPig” project) en door INRAE HOLOFLUX (“Holopig” project). De auteurs zijn de Genotoul core facilities (TRI) dankbaar. We danken Christelle Knudsen (GenPhySE, INRAE, Toulouse) voor het zorgvuldig proeflezen.

Materials

0.5 M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific AM9260G Store at room temperature.
15 mL conical tube Sarstedt 62.554.502
24-well cell culture plate Corning 003526
48-well cell culture plate Corning 003548
50 mL polypropylene conical tube Falcon 352070
Bovine Serum Albumine (BSA) Euromedex A6003 Store at 4 °C.
Centrifuge Universal 320 R Hettich 1406
Collagene type IV from human placenta Sigma C5533 Prepare the stock solution at 1 mg/mL in acetic acid according to the manufacturer's recommendation. Aliquot (500 µL) and store at -20 °C.
CoolCell LX Cell Freezing Container Corning 432003 Used to cryopreserve crypts and organoids.
Countess 3 Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific 16842556
Coverslips, 22 mm x 50 mm VWR 630-1845
Cryotube ClearLine 1 mL Clear line 390706 Used to cryopreserve crypts and organoids.
DAPI Invitrogen D1306 Prepare the stock solution at 5 mg/mL in water according to the manufacturer’s recommendation. Aliquot (20 µL) and store at -20 °C
Dithiothreitol (DTT) Merck 10197777001 Store at 4 °C.
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate Thermo Fisher Scientific 31966047 Store at 4 °C.
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) Corning 25-950-CQC Store at room temperature.
Epredia Superfrost Plus Adhesion microscopic slide VWR 631-9483
Fetal Bovine Serum (FBS) Thermo Fisher Scientific 10270-106 Store 5 mL aliquots at -20 °C.
Fisherbrand Sterile Cell Strainers Thermo Fisher Scientific 22363549 Used for crypt isolation.
Fixed Tilt 3D Platform Rotator VWR 97025-564 Used for incubations in the immunostaining protocol.
Gibco PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010015 Store at 4 °C.
Gibco TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red Thermo Fisher Scientific 12605-010 Enzyme dissociation reagent. Store at room temperature.
Goat anti-rabbit IgG, Alexa fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11008 Secondary antibody. Store at 4 °C. Working dilution 1:1000.
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) Stem Cell Technology 6010 Organoid culture medium. Store at -20 °C. Thaw the basal medium and organoid supplement at room temperature and mix (1:1). Store the mix at 4 °C for up to 1 week.
Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells Corning 353095
Inverted microscope Nikon Eclipse TS2
Matrigel Basement Membrane Matrix Corning 354234 Tumor-derived extracellular matrix used for the 3D culture of organoids. Matrigel polymerizes at room temperature. Use cooled tips to pipet the Matrigel. Prepare 500 µL aliquots and store at -20 °C.
Mounting medium for fluorescence with DAPI Vectashield H1250 Store at 4 °C.
Occludin polyclonal antibody Thermo Fisher Scientific 71-1500 Primary antibody. Store at -20 °C. Working dilution 1:200.
Paraformaldehyde 32% Electron microscopy science 15714 Prepare 4% paraformaldehyde (PFA) solution under chemical hood by adding 5 mL of 32% PFA to 35 mL of PBS. Aliquot by 10 mL and store at -20 °C.
Penicillin-Streptomycin Sigma P4333 Antibacterial. Store 5 mL aliquots at -20 °C.
Phalloidin TRITC Sigma P1951 Probe for actin staining. 1 mg/mL stock solution. Store at 4 °C.
Primocin InvivoGen ant-pm-05 Antimicrobial agent for primary cells acting on bacteria, mycoplasma and fungi. Store at -20 °C.
ROCK Inhibitor (Y27632) ATCC ACS-3030 Used to maintain the stem cells. Prepare the stock solution at 10 mM in sterile water according to the manufacturer's recommendation and store aliquots (50 µL) at -20 °C.
Rotating shaker mix XL Clear line 062646CL Used for crypt isolation.
Stripette Serological Pipets 10 mL Corning 4488
Tissue Culture Dish TPP 93100
Triton X100 Sigma 8787 Store at room temperature.
Trypan Blue stain 0.4% Thermo Fisher Scientific T10282 Store at room temperature.
Vacuum system Vacusip Integra 159000 Used to remove the medium of organoid wells.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 141-153 (2014).
  2. In, J. G., et al. Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).
  3. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  4. Beaumont, M., et al. Intestinal organoids in farm animals. Veterinary Research. 52 (1), 33 (2021).
  5. Gonzalez, L. M., Williamson, I., Piedrahita, J. A., Blikslager, A. T., Magness, S. T. Cell lineage identification and stem cell culture in a porcine model for the study of intestinal epithelial regeneration. PLoS One. 8 (6), 66465 (2013).
  6. Holthaus, D., Delgado-Betancourt, E., Aebischer, T., Seeber, F., Klotz, C. Harmonization of protocols for multi-species organoid platforms to study the intestinal biology of toxoplasma gondii and other protozoan infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 610368 (2021).
  7. Powell, R. H., Behnke, M. S. WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals. Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).
  8. Li, L., et al. Porcine intestinal enteroids: a new model for studying enteric coronavirus porcine epidemic diarrhea virus infection and the host innate response. Journal of Virology. 93 (5), 01682 (2019).
  9. vander Hee, B., Madsen, O., Vervoort, J., Smidt, H., Wells, J. M. Congruence of transcription programs in adult stem cell-derived jejunum organoids and original tissue during long-term culture. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 375 (2020).
  10. Barnett, A. M., et al. Porcine colonoids and enteroids keep the memory of their origin during regeneration. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (5), 794-805 (2021).
  11. Mussard, E., et al. The phenotype of the gut region is more stably retained than developmental stage in piglet intestinal organoids. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983031 (2022).
  12. Zhu, M., Qin, Y. -. C., Gao, C. -. Q., Yan, H. -. C., Wang, X. -. Q. l-Glutamate drives porcine intestinal epithelial renewal by increasing stem cell activity via upregulation of the EGFR-ERK-mTORC1 pathway. Food & Function. 11 (3), 2714-2724 (2020).
  13. Wang, Z., et al. Dietary vitamin A affects growth performance, intestinal development, and functions in weaned piglets by affecting intestinal stem cells. Journal of Animal Science. 98 (2), (2020).
  14. Derricott, H., et al. Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species. Cell and Tissue Research. 375 (2), 409-424 (2019).
  15. Khalil, H. A., et al. A novel culture system for adult porcine intestinal crypts. Cell and Tissue Research. 365 (1), 123-134 (2016).
  16. Stewart, A. S., Freund, J. M., Gonzalez, L. M. Advanced three-dimensional culture of equine intestinal epithelial stem cells. Equine Veterinary Journal. 50 (2), 241-248 (2018).
  17. Tsai, Y. -. H., et al. A method for cryogenic preservation of human biopsy specimens and subsequent organoid culture. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (2), 218-222 (2018).
  18. Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).
  19. Li, Y., et al. Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations. Journal of Virology. 94 (21), 01006-01020 (2020).
  20. Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis. Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).
  21. vander Hee, B., et al. Optimized procedures for generating an enhanced, near physiological 2D culture system from porcine intestinal organoids. Stem Cell Research. 28, 165-171 (2018).
  22. Hoffmann, P., et al. Intestinal organoid-based 2D monolayers mimic physiological and pathophysiological properties of the pig intestine. PLoS One. 16 (8), 0256143 (2021).
  23. Vermeire, B., Gonzalez, L. M., Jansens, R. J. J., Cox, E., Devriendt, B. Porcine small intestinal organoids as a model to explore ETEC-host interactions in the gut. Veterinary Research. 52 (1), 94 (2021).
  24. Luo, H., et al. Utility evaluation of porcine enteroids as PDCoV infection model in vitro. Frontiers in Microbiology. 11, 821 (2020).
  25. Resende, T. P., Medida, R. L., Vannucci, F. A., Saqui-Salces, M., Gebhart, C. Evaluation of swine enteroids as in vitro models for Lawsonia intracellularis infection1,2. Journal of Animal Science. 98 (2), 011 (2020).
  26. Engevik, A. C., et al. Editing myosin VB gene to create porcine model of microvillus inclusion disease, with microvillus-lined inclusions and alterations in sodium transporters. Gastroenterology. 158 (8), 2236-2249 (2020).
  27. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  28. Gracz, A. D., Puthoff, B. J., Magness, S. T. Identification, isolation, and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine. Somatic Stem Cells: Methods and Protocols. 879, 89-107 (2012).
  29. Ferrandis Vila, M., et al. Dietary fiber sources and non-starch polysaccharide-degrading enzymes modify mucin expression and the immune profile of the swine ileum. PloS One. 13 (11), 0207196 (2018).
  30. Li, L., et al. IFN-lambda 3 mediates antiviral protection against porcine epidemic diarrhea virus by inducing a distinct antiviral transcript profile in porcine intestinal epithelia. Frontiers in Immunology. 10, 2394 (2019).
  31. VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).
  32. Sutton, K. M., Orr, B., Hope, J., Jensen, S. R., Vervelde, L. Establishment of bovine 3D enteroid-derived 2D monolayers. Veterinary Research. 53 (1), 15 (2022).

Tags

Pig Intestinal EpitheliumIntestinal Organoids3D OrganoidsCryopreserved CryptsEpithelial Crypts2D MonolayersNutrient TransportBarrier FunctionHost-microbe InteractionsJejunumDuodenumIleumColonExtracellular MatrixECMCulture MediumPassagingDissociationDMEMRock Inhibitor

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Mussard, E., Lencina, C., Boudry, G., Achard, C. S., Klotz, C., Combes, S., Beaumont, M. Culture of Piglet Intestinal 3D Organoids from Cryopreserved Epithelial Crypts and Establishment of Cell Monolayers. J. Vis. Exp. (192), e64917, doi:10.3791/64917 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image