ثقافة الخنازير المعوية 3D العضوية من الخبايا الظهارية المحفوظة بالتبريد وإنشاء أحاديات الخلية
Summary
هنا ، وصفنا بروتوكولا لثقافة الخنازير المعوية 3D organoids من الخبايا الظهارية المحفوظة بالتبريد. نحن أيضا وصف طريقة لإنشاء أحادي الخلية المستمدة من المواد العضوية 3D ، مما يسمح بالوصول إلى الجانب القمي للخلايا الظهارية.
Abstract
يتم استخدام الكائنات العضوية المعوية بشكل متزايد لدراسة ظهارة الأمعاء لنمذجة أمراض الجهاز الهضمي ، أو للتحقيق في التفاعلات مع الأدوية والمغذيات والمستقلبات ومسببات الأمراض والميكروبات. تتوفر الآن طرق لاستزراع العضويات المعوية لأنواع متعددة ، بما في ذلك الخنازير ، وهو نوع ذو أهمية كبيرة كحيوان مزرعة وكنموذج متعدي للبشر ، على سبيل المثال ، لدراسة الأمراض الحيوانية المنشأ. هنا ، نقدم وصفا متعمقا لإجراء يستخدم لثقافة عضويات 3D المعوية للخنزير من الخبايا الظهارية المجمدة. يصف البروتوكول كيفية حفظ الخبايا الظهارية بالتبريد من أمعاء الخنزير والإجراءات اللاحقة لثقافة المواد العضوية المعوية 3D. المزايا الرئيسية لهذه الطريقة هي (i) التفكك الزمني لعزل الخبايا من ثقافة المواد العضوية 3D ، (ii) إعداد مخزونات كبيرة من الخبايا المحفوظة بالتبريد المشتقة من شرائح معوية متعددة ومن عدة في وقت واحد ، وبالتالي (iii) تقليل الحاجة إلى أخذ عينات من الأنسجة الطازجة من الحيوانات الحية. نقوم أيضا بتفصيل بروتوكول لإنشاء طبقة أحادية الخلية مشتقة من عضويات 3D للسماح بالوصول إلى الجانب القمي للخلايا الظهارية ، وهو موقع التفاعلات مع العناصر الغذائية أو الميكروبات أو الأدوية. بشكل عام ، تعد البروتوكولات الموضحة هنا موردا مفيدا لدراسة ظهارة معوية الخنازير في البحوث البيطرية والطبية الحيوية.
Introduction
تتكون ظهارة الأمعاء من طبقة أحادية من الخلايا تغطي الغشاء المخاطي الهضمي عند الواجهة مع البيئة اللمعية. يرتبط هذا الوضع بوظائف متنوعة ، مثل امتصاص المغذيات ووظيفة الحاجز الواقي ، والتي يدعمها وجود الخلايا الجذعية وأنواع الخلايا الظهارية المتمايزة المتعددة (الخلايا الامتصاصية ، والغدد الصماء المعوية ، والبانيث ، والكأس)1. خطوط الخلايا الخالدة المستخدمة تقليديا لدراسة الخلايا الظهارية لها قيود كبيرة ، لأنها لا تعكس التعقيد الخلوي للظهارة المعوية وتقدم تشوهات جينومية2. قدم تطوير المواد العضوية ثلاثية الأبعاد (3D) بواسطة Sato et al.3 نموذجا جديدا لدراسة ظهارة الأمعاء ذات الصلة الفسيولوجية المحسنة. في الواقع ، تستمد الكائنات العضوية المعوية من الخلايا الجذعية غير المحولة ، وتتكون من أنواع متعددة من الخلايا ، وتلخص وظائف ظهارة الأمعاء. يتم استخدام الكائنات العضوية المعوية بشكل متزايد لفهم تطور ووظائف ظهارة الأمعاء وتفاعلاتها مع مسببات الأمراض والمواد المغذية والسموم والأدوية والميكروبات ومستقلباتها2.
تم تطوير الطرق المستخدمة في زراعة الكائنات العضوية المعوية في البداية للبشر والفئران ، وقد تم تكييفها مؤخرا مع الأنواع الأخرى ، بما في ذلك الخنازير4. كان Gonzales et al.5 أول من استزرع عضويات الخنازير من الصائم. منذ ذلك الحين ، تم وصف عضويات الخنازير لقطاعات الأمعاء الأخرى (الاثني عشر ، الدقاق ، والقولون) 6،7،8 ، وقد ثبت أنها تحتفظ بالنمط الظاهري الخاص بالموقع9،10،11. تستخدم الآن عضويات 3D المعوية للخنزير بشكل شائع لدراسة تأثير العناصر الغذائية12,13 أو الالتهابات المعوية 6,8,14.
وصفت معظم الدراسات ثقافة الكائنات العضوية المعوية بدءا من الخبايا الظهارية المعزولة حديثا. ومع ذلك ، فإن هذا ليس ممكنا دائما لأسباب لوجستية ، لا سيما عند العمل مع الحيوانات الكبيرة مثل الخنازير. في الواقع ، يمكن أن تكون المرافق الحيوانية للخنازير بعيدة عن المختبر حيث يتم استزراع المواد العضوية ، مما يعقد تنظيم العمل. علاوة على ذلك ، فإن الثقافة العضوية تستغرق وقتا طويلا. وبالتالي ، ليس من العملي زراعة خطوط عضوية متعددة في وقت واحد ، على سبيل المثال ، من قطاعات أمعاء مختلفة أو عدة. للتحايل على هذه المشكلات ، وصفت بعض الدراسات التي أجريت على البشر والخيول والخنازير طرقا لزراعة المواد العضوية من الأنسجة المعوية المجمدة (أو الخزعات) أو من الخبايا الظهارية المعزولة4،15،16،17. تسمح هذه الطرق بالحفظ بالتبريد للخلايا الجذعية الظهارية المعوية من أجزاء أمعاء متعددة لحيوان واحد ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لزراعة المواد العضوية عند الحاجة. علاوة على ذلك ، يسمح هذا بانخفاض قوي في عدد الحيوانات الحية المستخدمة كمتبرعين للخلايا الجذعية ، حيث يمكن إنشاء مخزونات كبيرة من الخبايا المحفوظة بالتبريد (مبادئ 3R). ميزة أخرى لهذه الطريقة هي نمو الكائنات العضوية المعوية فقط من الحيوانات ذات الأهمية بعد الحصول على نتائج النمط الظاهري أو الوراثي ، وهو فعال للغاية من حيث التكلفة.
في الجسم الحي ، تستقطب الخلايا الظهارية المعوية ، مع توجيه الجانب القمي نحو التجويف. في المختبر ، في المواد العضوية ثلاثية الأبعاد ، يواجه الجانب القمي للخلايا الظهارية أيضا التجويف (أي داخل المواد العضوية)4. تمنع هذه المنظمة الوصول إلى الجانب القمي ، وهي مشكلة عند دراسة تأثيرات المكونات اللمعية (مثل العناصر الغذائية والميكروبات والمستقلبات) على الخلايا الظهارية. للتحايل على هذا العيب ، تم تطوير عدة طرق ، مثل زراعة الخلايا العضوية كطبقة أحادية 2D ، والحقن المجهري ، وانعكاس القطبية (“المواد العضوية القمية”)18,19. تظهر ثقافة الخلايا العضوية أحادية الطبقات باعتبارها النظام الأكثر كفاءة وقابلية للتتبع. المبدأ هو فصل المواد العضوية 3D إلى خلايا مفردة وزرعها على وعاء زراعة الخلايا المغلفة مسبقا بطبقة رقيقة من المصفوفة خارج الخلية (ECM) 20. في ظروف الاستزراع هذه ، يكون الجانب القمي للخلايا الظهارية متجها لأعلى ، وبالتالي يمكن الوصول إليه من خلال العلاجات التجريبية20. تم تكييف ثقافة أحاديات الخلايا العضوية مؤخرا لأمعاء الخنزير21,22. تم استخدام أحاديات الخلايا المشتقة من عضويات الخنازير ثلاثية الأبعاد لتطبيقات متعددة ، بما في ذلك دراسة الالتهابات المعوية6،23،24،25 ، ونقل العناصر الغذائية9 ، ونمذجة أمراض الجهاز الهضمي 26.
هنا ، تقدم هذه الدراسة أولا بروتوكولا مفصلا لثقافة وصيانة عضويات 3D المعوية للخنازير المشتقة من الخبايا الظهارية المحفوظة بالتبريد (الشكل 1). ثم ، يتم وصف بروتوكول لإنشاء أحاديات الخلايا من عضويات 3D المعوية الخنازير. توفر الطرق الموصوفة هنا أدوات تجريبية يمكن استخدامها لدراسة ظهارة معوية الخنازير لنقل المغذيات ، ووظيفة الحاجز ، والتفاعلات بين الكائنات الحية الدقيقة والمضيف.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول طريقة تستخدم لحفظ الخبايا الظهارية بالتبريد من الأمعاء الصغيرة للتخزين طويل الأجل والثقافة اللاحقة للمواد العضوية 3D. يستخدم هذا البروتوكول محلول تجميد يحتوي على DMSO و FBS ومثبط Y27632 ROCK و DMEM والمضادات الحيوية. حصلت دراسة أخرى أجريت على الخنازير على عضويات من خبايا محفوظة بالتبريد في محلول تجميد مماثل ولكن بدون مثبط ROCK15. تم تضمين مثبط Y27632 ROCK لمنع موت الخلايا المبرمج والحفاظ على تجمع الخلايا الجذعية لأنه بعد ذوبان الجليد ، يتم فصل خلايا القبو الظهارية ، مما قد يؤدي إلى موت الخلايا (“anoikis”) 27،28. ومن المثير للاهتمام أنه تم الحصول على الخيول المعوية من الخبايا الظهارية المجمدة في وسط استزراع يحتوي فقط على DMEM و DMSO16. لم يتم اختبار هذه الطريقة البسيطة للخبايا الظهارية الخنازير حتى الآن. تم نشر طرق أخرى لزراعة الكائنات العضوية البشرية والخنازير من الأنسجة المجمدة أو الخزعات بدلا من الخبايا الظهارية 4,17. ميزة هذه الطريقة هي القدرة على حفظ الأنسجة المعوية بالتبريد مباشرة دون إجراء إجراء عزل القبو ، الأمر الذي يتطلب وقتا ومعدات مختبرية. قد يكون هذا مناسبا عندما يتعين جمع الأنسجة بعيدا عن المختبر. ومع ذلك ، عند عزل الخبايا مباشرة بعد الذبح ، يمكن معالجة أجزاء كبيرة من الأمعاء للحصول على عدد كبير جدا من الخبايا ، وهذا ليس هو الحال عند البدء من شظايا الأنسجة الصغيرة المجمدة. بعد ذوبان الخبايا الظهارية ، لوحظت المواد العضوية من 3-4 أيام بعد البذر وانقسامها بعد 10 أيام. هذا معدل نمو أبطأ مما كان عليه عند بدء الاستزراع من الخبايا الظهارية الطازجة ، والتي تم الحصول على المواد العضوية من اليوم الأول بعد البذر ، ويمكن عادة تقسيمها في حوالي اليوم 511. كما أبلغ خليل وآخرون عن تأخر نمو معوية الخنازير عند البدء من الخباياالمجمدة 15 ، مما يشير إلى أن الخلايا الجذعية قد تتطلب وقتا لاستعادة قدرتها على التكاثر. حصلنا أيضا على عدد أقل من المواد العضوية عند البدء من الخبايا المجمدة مقارنة بالخبايا الطازجة ، والتي قد تكون بسبب موت الخلايا الجذعية أثناء عملية التجميد. في بعض محاولات ذوبان الخبايا (<20٪) ، لم نحصل على مواد عضوية من الخبايا المجمدة ، ربما بسبب إجراء الحفظ بالتبريد دون المستوى الأمثل (على سبيل المثال ، تأخر التجميد بعد عزل القبو ربما أكثر من 1 ساعة). وبالتالي ، نوصي بإبقاء الخبايا على الجليد حتى العد ، وتجميدها في أسرع وقت ممكن.
بالنسبة إلى المواد العضوية 3D ، اخترنا استخدام وسيط ثقافة عضوي تجاري مصمم للبشر. في الواقع ، أظهرت التقارير السابقة أن الكائنات العضوية المعوية للخنازير تنمو بكفاءة مع هذه الوسيلة8،11،14،19،25،26،29،30. من المهم أن يكون وسيط الاستزراع هذا جاهزا للاستخدام وأن يكون له تركيز موحد لعوامل النمو داخل الدفعة. ومع ذلك ، فإن هذه الوسيلة الثقافية مكلفة ، وتكوينها غير معلن ، وبالتالي لا يمكن تعديل تكوينها. في المقابل ، قامت دراسات أخرى بزراعة عضويات معوية للخنزير في وسائط مخصصة تحتوي على مثبطات دوائية و / أو عامل نمو مؤتلف و / أو وسائط مشروطة5،6،7،21. على الرغم من أن هذه الطريقة مرنة للغاية وأرخص ، إلا أنها تستغرق وقتا طويلا لإنتاج وسائط مكيفة وقد تفتقر إلى قابلية التكرار بسبب التباين المحتمل في تركيز عوامل النمو في الوسائط المكيفة. وبالتالي ، يجب التحقق من جودة كل دفعة من الوسائط المكيفة عن طريق قياس نمو الأعضاء أو التعبير الجيني للعلامة31.
أظهرت دراسة أن عضويات الخنازير الصائمية المستزرعة في نفس وسط الاستزراع العضوي التجاري المستخدم هنا نمت بشكل أسرع وبدت أقل تمايزا ، مقارنة بالكائنات المعوية المستزرعة بوسائط تحتوي على عامل نمو مؤتلف و / أو وسائط مشروطة23. تسهل الحالة التكاثرية العالية ثقافة المواد العضوية 3D ، ولكنها قد تتطلب إحداث تمايز لتكون أكثر تمثيلا للخصائص الفسيولوجية المعوية. في هذا البروتوكول ، لمرور المواد العضوية 3D ، يتم فصل الخلايا بالكامل للعد ، مما يسمح بالتحكم في عدد الخلايا المصنفة في ECM. هذا يزيد من استنساخ النمط الظاهري للعضويات ، والذي يتأثر بشدة بكثافتها. علاوة على ذلك ، فإن عد الخلايا يتجنب الحصول على ثقافة منخفضة للغاية أو مكتظة ، مما يتطلب تكييف جدول الثقافة. أعدت معظم الدراسات الأخرى شظايا عضوية غير منفصلة تماما إلى خلايا مفردة ، واستخدمت نسبة تخفيف للتمرير. هذه الطريقة أكثر وضوحا ، ولكنها قد تحفز التباين وفقا للكثافة العضوية للثقافة.
بالنسبة للثقافة في الطبقات الأحادية ، يتم زرع الخلايا العضوية في إدخالات الثقافة المغلفة مسبقا بطبقة رقيقة من ECM ، والتي تسمح بربط الخلايا ولكنها تتجنب نمو المواد العضوية في 3D. استخدم هذا البروتوكول الكولاجين من النوع الرابع كبروتين ECM ، كما هو موضح سابقا في الخنازير23. استخدمت دراسات أخرى مع أحاديات عضوية الخنازير نفس ECM المشتق من الورم المستخدم هنا لثقافة المواد العضوية ثلاثية الأبعاد6،8،9،21،25،30. ميزة استخدام الكولاجين هي القدرة على توحيد تركيز البروتين بتركيبة محددة تماما ، وهذا ليس هو الحال في ECM المشتق من الورم. تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة لنجاح ثقافة أحاديات الطبقة الخلوية في الانتباه إلى المظهر المرئي للعضويات 3D السلائف ، والتي يجب أن يكون لها حواف محددة جيدا وتجويف فارغ بدون حطام أسود. في الواقع ، المواد العضوية ذات مستوى النضج العالي ومعدل التكاثر المنخفض ليست مصدرا مناسبا للخلايا لثقافة 2D. وبالتالي ، فإن توقيت تفكك المواد العضوية 3D إلى خلايا مفردة أمر بالغ الأهمية لنجاح هذه الخطوة.
تسمح ثقافة 2D monolayers من الخلايا المفردة بتوحيد عدد الخلايا المصنفة ، وهو أمر أكثر صعوبة عند البدء من شظايا عضوية ، كما هو الحال في بعض الطرق الأخرى. لقد زرعنا 7.6 × 10 5 خلايا لكل سم 2 ، وهي نسبة عالية مقارنة بمعظم الدراسات الأخرى 21،22،23 في الخنازير التي استخدمت كثافة خلايا أقل ، تتراوح من 0.25 × 10 5 خلايا لكل سم 2 إلى 1.78 × 10 5 خلايا لكل سم 2. يشكل شرط وجود عدد كبير من الخلايا العضوية قيدا على هذا البروتوكول ، لكنه سمح لنا بالحصول بسرعة على طبقة أحادية متقاربة ، تغطي بالكامل إدراج الثقافة بعد يوم 1. في المقابل ، حصل Vermeire et al.23 على التقاء بعد 4-7 أيام بكثافة أقل من الخلايا المصنفة (من 0.25 × 105 خلايا / سم 2 إلى 0.4 × 105 خلايا / سم2). استخدمت بعض الدراسات أيضا أحاديات الخلايا العضوية للخنزير التي لم تغطي سطح الثقافة بالكامل للعدوى بالفيروسات 8,30. في هذه الظروف ، يمكن الوصول إلى الجانب القمي للخلايا الظهارية للعلاج ، ولكن هناك حاجة إلى طبقات أحادية متقاربة تماما إذا كان الهدف هو دراسة امتصاص المغذيات أو نفاذية الظهارة.
بالنسبة للخلايا العضوية أحادية الطبقة ، تم استخدام وسط استزراع عضوي تجاري مكمل بنسبة 20٪ FBS ، بناء على دراسة حديثة على الطبقات الأحادية المشتقة من الأمعاءالبقري 32. في اختباراتنا، كانت المكملات التي تحتوي على 20٪ FBS ضرورية للحصول على طبقة أحادية متقاربة بالكامل، ربما بسبب متطلبات عامل النمو المرتفع. على العكس من ذلك ، أنشأت دراسات أخرى تستخدم نفس الوسيط التجاري طبقة أحادية بدون FBSإضافي 8،25،30 ، ولكن دون الوصول إلى التقاء كامل. استخدمت دراسات أخرى أيضا مكملات تحتوي على 20٪ FBS في وسط مخصص لثقافة أحاديات الخلايا العضوية للخنزير21,22. في تجاربنا ، يكون TEER مرتفعا بعد يوم واحد من البذر (حوالي 700 Ω سم 2) ، ويظل مرتفعا حتى اليوم الثالث (حوالي 1500 Ω سم2 ؛ وهذا يتوافق مع تكوين تقاطعات ضيقة ، كما يتضح من تعبير الإطباق. حصل Van der Hee et al. على قيم TEER مماثلة تزيد عن 72 ساعة لأحاديات الطبقة أحادية الخلايا العضوية الصائمية21. كما أظهروا أنه يمكن الحفاظ على الطبقات الأحادية حتى اليوم 12-15 مع تغييرات الوسائط اليومية. في المقابل ، أبلغت دراسات أخرى عن قيم TEER أقل بكثير (حوالي 200 Ω · سم2) للطبقة الأحادية للخلايا العضويةالخنازير 6,22. قد تكون هذه الاختلافات بين الدراسات مرتبطة بجزء القناة الهضمية الذي تمت دراسته أو بالوسائط المستخدمة التي تؤثر على التمايز الظهاري.
في الختام ، فإن البروتوكول أعلاه لزراعة عضويات 3D المعوية للخنزير من الخبايا الظهارية المجمدة يسهل تنظيم عمل الثقافة. يقلل من الحاجة إلى الحصول على الأنسجة الطازجة من الحيوانات الحية. نوضح أيضا كيفية إنشاء أحاديات الخلايا المتقاربة بالكامل المشتقة من عضويات الخنازير في أقل من 3 أيام. وبالتالي ، يمكن أن تكون بروتوكولاتنا موارد مفيدة للعلماء الذين يدرسون ظهارة معوية الخنازير للبحوث البيطرية أو الطبية الحيوية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل معهد كارنو فرنسا فيوتشر إليفاج (“مشروع OrganoPig”) ومن قبل INRAE HOLOFLUX (“مشروع Holopig”). المؤلفون ممتنون لمرافق Genotoul الأساسية (TRI). نحن نقدر كريستيل كنودسن (GenPhySE ، INRAE ، تولوز) للتدقيق اللغوي الدقيق.
Materials
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | Store at room temperature. |
| 15 mL conical tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 24-well cell culture plate | Corning | 003526 | |
| 48-well cell culture plate | Corning | 003548 | |
| 50 mL polypropylene conical tube | Falcon | 352070 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Euromedex | A6003 | Store at 4 °C. |
| Centrifuge Universal 320 R | Hettich | 1406 | |
| Collagene type IV from human placenta | Sigma | C5533 | Prepare the stock solution at 1 mg/mL in acetic acid according to the manufacturer's recommendation. Aliquot (500 µL) and store at -20 °C. |
| CoolCell LX Cell Freezing Container | Corning | 432003 | Used to cryopreserve crypts and organoids. |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | 16842556 | |
| Coverslips, 22 mm x 50 mm | VWR | 630-1845 | |
| Cryotube ClearLine 1 mL | Clear line | 390706 | Used to cryopreserve crypts and organoids. |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Prepare the stock solution at 5 mg/mL in water according to the manufacturer’s recommendation. Aliquot (20 µL) and store at -20 °C |
| Dithiothreitol (DTT) | Merck | 10197777001 | Store at 4 °C. |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 31966047 | Store at 4 °C. |
| DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Corning | 25-950-CQC | Store at room temperature. |
| Epredia Superfrost Plus Adhesion microscopic slide | VWR | 631-9483 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | Store 5 mL aliquots at -20 °C. |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers | Thermo Fisher Scientific | 22363549 | Used for crypt isolation. |
| Fixed Tilt 3D Platform Rotator | VWR | 97025-564 | Used for incubations in the immunostaining protocol. |
| Gibco PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010015 | Store at 4 °C. |
| Gibco TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12605-010 | Enzyme dissociation reagent. Store at room temperature. |
| Goat anti-rabbit IgG, Alexa fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | Secondary antibody. Store at 4 °C. Working dilution 1:1000. |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | Stem Cell Technology | 6010 | Organoid culture medium. Store at -20 °C. Thaw the basal medium and organoid supplement at room temperature and mix (1:1). Store the mix at 4 °C for up to 1 week. |
| Insert with PET membrane transparent Falcon for plate 24 wells | Corning | 353095 | |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS2 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | Tumor-derived extracellular matrix used for the 3D culture of organoids. Matrigel polymerizes at room temperature. Use cooled tips to pipet the Matrigel. Prepare 500 µL aliquots and store at -20 °C. |
| Mounting medium for fluorescence with DAPI | Vectashield | H1250 | Store at 4 °C. |
| Occludin polyclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | 71-1500 | Primary antibody. Store at -20 °C. Working dilution 1:200. |
| Paraformaldehyde 32% | Electron microscopy science | 15714 | Prepare 4% paraformaldehyde (PFA) solution under chemical hood by adding 5 mL of 32% PFA to 35 mL of PBS. Aliquot by 10 mL and store at -20 °C. |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | Antibacterial. Store 5 mL aliquots at -20 °C. |
| Phalloidin TRITC | Sigma | P1951 | Probe for actin staining. 1 mg/mL stock solution. Store at 4 °C. |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-05 | Antimicrobial agent for primary cells acting on bacteria, mycoplasma and fungi. Store at -20 °C. |
| ROCK Inhibitor (Y27632) | ATCC | ACS-3030 | Used to maintain the stem cells. Prepare the stock solution at 10 mM in sterile water according to the manufacturer's recommendation and store aliquots (50 µL) at -20 °C. |
| Rotating shaker mix XL | Clear line | 062646CL | Used for crypt isolation. |
| Stripette Serological Pipets 10 mL | Corning | 4488 | |
| Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
| Triton X100 | Sigma | 8787 | Store at room temperature. |
| Trypan Blue stain 0.4% | Thermo Fisher Scientific | T10282 | Store at room temperature. |
| Vacuum system Vacusip | Integra | 159000 | Used to remove the medium of organoid wells. |
References
- Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 141-153 (2014).
- In, J. G., et al. Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Beaumont, M., et al. Intestinal organoids in farm animals. Veterinary Research. 52 (1), 33 (2021).
- Gonzalez, L. M., Williamson, I., Piedrahita, J. A., Blikslager, A. T., Magness, S. T. Cell lineage identification and stem cell culture in a porcine model for the study of intestinal epithelial regeneration. PLoS One. 8 (6), 66465 (2013).
- Holthaus, D., Delgado-Betancourt, E., Aebischer, T., Seeber, F., Klotz, C. Harmonization of protocols for multi-species organoid platforms to study the intestinal biology of toxoplasma gondii and other protozoan infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 610368 (2021).
- Powell, R. H., Behnke, M. S. WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals. Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).
- Li, L., et al. Porcine intestinal enteroids: a new model for studying enteric coronavirus porcine epidemic diarrhea virus infection and the host innate response. Journal of Virology. 93 (5), 01682 (2019).
- vander Hee, B., Madsen, O., Vervoort, J., Smidt, H., Wells, J. M. Congruence of transcription programs in adult stem cell-derived jejunum organoids and original tissue during long-term culture. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 375 (2020).
- Barnett, A. M., et al. Porcine colonoids and enteroids keep the memory of their origin during regeneration. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 320 (5), 794-805 (2021).
- Mussard, E., et al. The phenotype of the gut region is more stably retained than developmental stage in piglet intestinal organoids. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983031 (2022).
- Zhu, M., Qin, Y. -. C., Gao, C. -. Q., Yan, H. -. C., Wang, X. -. Q. l-Glutamate drives porcine intestinal epithelial renewal by increasing stem cell activity via upregulation of the EGFR-ERK-mTORC1 pathway. Food & Function. 11 (3), 2714-2724 (2020).
- Wang, Z., et al. Dietary vitamin A affects growth performance, intestinal development, and functions in weaned piglets by affecting intestinal stem cells. Journal of Animal Science. 98 (2), (2020).
- Derricott, H., et al. Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species. Cell and Tissue Research. 375 (2), 409-424 (2019).
- Khalil, H. A., et al. A novel culture system for adult porcine intestinal crypts. Cell and Tissue Research. 365 (1), 123-134 (2016).
- Stewart, A. S., Freund, J. M., Gonzalez, L. M. Advanced three-dimensional culture of equine intestinal epithelial stem cells. Equine Veterinary Journal. 50 (2), 241-248 (2018).
- Tsai, Y. -. H., et al. A method for cryogenic preservation of human biopsy specimens and subsequent organoid culture. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 6 (2), 218-222 (2018).
- Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).
- Li, Y., et al. Next-generation porcine intestinal organoids: an apical-out organoid model for swine enteric virus infection and immune response investigations. Journal of Virology. 94 (21), 01006-01020 (2020).
- Moon, C., VanDussen, K. L., Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. Development of a primary mouse intestinal epithelial cell monolayer culture system to evaluate factors that modulate IgA transcytosis. Mucosal Immunology. 7 (4), 818-828 (2014).
- vander Hee, B., et al. Optimized procedures for generating an enhanced, near physiological 2D culture system from porcine intestinal organoids. Stem Cell Research. 28, 165-171 (2018).
- Hoffmann, P., et al. Intestinal organoid-based 2D monolayers mimic physiological and pathophysiological properties of the pig intestine. PLoS One. 16 (8), 0256143 (2021).
- Vermeire, B., Gonzalez, L. M., Jansens, R. J. J., Cox, E., Devriendt, B. Porcine small intestinal organoids as a model to explore ETEC-host interactions in the gut. Veterinary Research. 52 (1), 94 (2021).
- Luo, H., et al. Utility evaluation of porcine enteroids as PDCoV infection model in vitro. Frontiers in Microbiology. 11, 821 (2020).
- Resende, T. P., Medida, R. L., Vannucci, F. A., Saqui-Salces, M., Gebhart, C. Evaluation of swine enteroids as in vitro models for Lawsonia intracellularis infection1,2. Journal of Animal Science. 98 (2), 011 (2020).
- Engevik, A. C., et al. Editing myosin VB gene to create porcine model of microvillus inclusion disease, with microvillus-lined inclusions and alterations in sodium transporters. Gastroenterology. 158 (8), 2236-2249 (2020).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- Gracz, A. D., Puthoff, B. J., Magness, S. T. Identification, isolation, and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine. Somatic Stem Cells: Methods and Protocols. 879, 89-107 (2012).
- Ferrandis Vila, M., et al. Dietary fiber sources and non-starch polysaccharide-degrading enzymes modify mucin expression and the immune profile of the swine ileum. PloS One. 13 (11), 0207196 (2018).
- Li, L., et al. IFN-lambda 3 mediates antiviral protection against porcine epidemic diarrhea virus by inducing a distinct antiviral transcript profile in porcine intestinal epithelia. Frontiers in Immunology. 10, 2394 (2019).
- VanDussen, K. L., Sonnek, N. M., Stappenbeck, T. S. L-WRN conditioned medium for gastrointestinal epithelial stem cell culture shows replicable batch-to-batch activity levels across multiple research teams. Stem Cell Research. 37, 101430 (2019).
- Sutton, K. M., Orr, B., Hope, J., Jensen, S. R., Vervelde, L. Establishment of bovine 3D enteroid-derived 2D monolayers. Veterinary Research. 53 (1), 15 (2022).
