凍結保存された上皮陰窩からの子豚腸3Dオルガノイドの培養と細胞単分子膜の樹立

この議定書は、科学的目的で使用される動物の保護に関する欧州指令(2010/63/EU)に従って、地元の倫理委員会(N°TOXCOM/0136/PP)によって承認されました。このプロトコルは、空腸について例として説明されていますが、小腸および大腸の各セグメント(十二指腸、空腸、回腸、結腸)に使用できます。 1.子豚の腸からの上皮陰窩の分離 注:10%ウシ胎児血清(FBS)と1%ペニシリン-ストレプトマイシン(P / S)を添加したDMEMを含む完全なダルベッコ改変イーグル培地(DMEMc)のストックを準備します。50 mLのアリコートを調製し、4°Cで1ヶ月間保存します。 溶液の準備(地下室隔離の日に行われる)リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、3 mMジチオスレイトール(DTT)、9 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、10 μM Y27632 ROCK阻害剤、および1%ペニシリン-ストレプトマイシン(P / S)を含む解離溶液を調製し、氷上に保存します。 DMEMc、10S、10%ジメチルスルホキシド(DMSO)、および10 μM Y27632 ROCK阻害剤を含む凍結溶液を調製し、氷上に保存します(最終FBS濃度は18%)。 1%P/Sを添加したコールドPBSを含む輸送液を調製し、氷上に保管します。 上皮陰窩の単離電気麻薬症とそれに続く放血によって子豚を屠殺する。 屠殺直後に、メスで子豚の腹部を開き、腸全体を取り除きます。 約2 cmの腸のセグメントを収集し、低温輸送液に保管します。陰窩分離まで(最大2時間)セグメントを氷上に保ちます。 ティッシュをペトリ皿に入れます。腸のセグメントを縦方向に開き、1%P / Sを添加した冷たいPBSで組織を注意深く洗浄して、腸の内容物を取り除きます。 組織を、1%P / Sを添加した10 mLの冷たいPBSで満たされた新しいペトリ皿に移します。 ピンセットで組織を保持し、顕微鏡スライドでこすることによって絨毛と残りの粘液を取り除きます。注:絨毛(舌状の構造)の除去は、上清の顕微鏡観察によって確認することができます。 組織を5 mLの氷冷解離溶液を含む15 mLのコニカルチューブに移し、回転シェーカー(15 rpm)で室温(RT)で30分間インキュベートします。 組織を新しいペトリ皿に移し、1%P / Sを添加した10mLの冷たいPBSを追加します。 顕微鏡スライドで粘膜をしっかりとこすることによって、陰窩を機械的に隔離します。注:顕微鏡下で、PBSに上皮陰窩が存在することを確認します(図2A)。 陰窩溶液を血清学的ピペットで吸引し、50 mLコニカルチューブ内の100 μmセルストレーナーを通してろ過します。 10μLの溶液をピペットし、顕微鏡下で陰窩の存在を確認します。300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 滅菌バイオセーフティキャビネットの下で、上清を廃棄し、10 μM Y27632 ROCK阻害剤を添加した10 mLのコールドDMEMcに陰窩のペレットを再懸濁します。 10 μLのクリプト溶液を48ウェルプレートにピペットします。顕微鏡下で10倍の倍率で陰窩の数を手動でカウントし、溶液1mLあたりの陰窩の濃度を計算します。注:単離された陰窩は、腸管オルガノイドの培養に直接使用できます。ただし、各子豚の地下室を大量に凍結保存し、後でオルガノイド培養に使用する方が便利なことがよくあります。 上皮陰窩の凍結900個の陰窩に相当する容量を15 mLのコニカルチューブに移します。300 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を廃棄し、陰窩のペレットを1 mLの凍結溶液に再懸濁します。クライオチューブに移し、バイアルを細胞凍結容器に入れます。 細胞凍結容器を-80°Cで24時間保存した後、バイアルを液体窒素に移して長期保存します。 2. 凍結上皮陰窩からの子豚腸管3Dオルガノイドの樹立 注:子豚の腸3Dオルガノイドは、ヒトオルガノイドの増殖用に処方された市販の培養培地で培養され、1%P / Sおよび初代細胞用の抗菌剤100 μg/mLが補充され、4°Cで最大1週間保存されます。腫瘍由来の細胞外マトリックス(ECM)は、3Dオルガノイドの培養に使用されます。市販製品のすべての参照は、 材料表に記載されています。 材料の準備ピペットチップを-20°C(少なくとも一晩)に置きます。 ECM(500 μL)の凍結アリコートを少なくとも1時間前に4°Cに置きます。 48ウェルプレートを37°C、5%CO2 インキュベーターで予熱します。 培養液をRTに置きます。 37°Cの水浴を予熱する。 無菌条件下でボンネットの下に小さな氷のバケツを置きます。 凍結上皮陰窩の融解900個の凍結陰窩を含むバイアルを37°Cの水浴(5分未満)で素早く解凍します。 クリプト溶液を15 mLコニカルチューブに移します。 300 x g でRTで5分間遠心分離し、上清を取り除きます 冷却されたチップで150 μLのECMを追加し、25 μLのECMあたり150の陰窩の最終濃度を得ます。ピペットを上下に10回使用して、ECM内の陰窩の均質な懸濁液を取得します。注意: 重合を避けるために、ECMは常に氷上に置いてください。ECMを操作するには、常に-20°Cで事前に冷却したピペットチップを使用してください。ECMで気泡が発生しないようにゆっくりとピペットします。このステップでは、小さな液滴が崩壊するのを防ぐために、希釈されていないECMが使用されます。 6つのウェルに、冷却したチップでウェルあたり25 μLのドロップを、事前に温めた48ウェルプレートに播種します。注意: 先端をウェルの中央に垂直に保ち、空気を導入せずにゆっくりとピペットでドームを作ります。ここでは、凍結した陰窩から始めるとオルガノイド数は通常低いため、48ウェルプレートが使用されます。 ECMの重合のために37°C、5%CO2 インキュベーターで30分間インキュベートします。 培養液1ウェルあたり250 μLをRTで添加します。 37°C、5%CO2 インキュベーターでインキュベートし、2〜3日ごとに培地を交換します。注:陰窩は通常、解凍手順後には見えず、ほとんどの細胞はECMで解離します(図2B)。 3. 凍結陰窩由来の子豚腸3Dオルガノイドの通過 注:凍結した陰窩からオルガノイドを入手する時間は、通常、新鮮な陰窩から始めるときよりも長くなります。オルガノイドは通常、解凍後10日で分割する準備が整います(図2B)。 材料の準備ECM(500 μL)の凍結アリコートを4°Cで少なくとも1時間置きます。 24ウェルプレートを37°Cで予熱します。 PBSと10 μM Y27632 ROCK阻害剤を添加した酵素解離試薬を37°Cの水浴中で予め温めます。 培養液をRTに置きます。 無菌条件下でボンネットの下に小さな氷のバケツを置きます。 凍結陰窩由来の3Dオルガノイドの通過培養液を取り出し、37°Cで250 μLの予熱PBSで洗浄します。 10 μM Y27632 ROCK阻害剤を添加した250 μLの酵素解離試薬を各ウェルに37°Cで加えます。注:オルガノイドの数が少ないため、オルガノイドの解離は各ウェルで直接行われます。 P1000ピペットで削ってECM内のオルガノイドを剥離し、5回ピペッティングして慎重にホモジナイズします。 37°C、5%CO2 インキュベーターで5分間インキュベートします。P1000ピペットを使用して上下に10回ピペッティングして細胞を解離します。注:目的は、単離された細胞またはスモールセルクラスター(<10セル)を取得することです。顕微鏡で解離を確認します。それでもオルガノイドの大きな断片が観察される場合は、手順3.2.4を繰り返します。 解離した細胞を含む各ウェルに500 μLのDMEMcを加え、3 mLのコールドDMEMcを含む15 mLのコニカルチューブに最大12個のウェルをプールします。 500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を廃棄し、ペレットを1 mLの冷DMEMcに再懸濁します。 セルカウンターでトリパンブルーで1:2に希釈した細胞を数えます。注: 自動セル カウンターは、存在する場合、小さなクラスター内のセルをカウントできます。 ドームあたり3,000個の生細胞(24ウェルプレートのウェルあたり1つのドーム)を持つために必要な量の細胞溶液を500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 氷上で生細胞3,000個あたり17 μLのコールドDMEMcで細胞を再懸濁します。必要なウェル数に容量を調整します。 3,000生細胞あたり冷却チップで33 μLのコールドECMをゆっくりと加え、気泡を作らずに氷上で均質化します。必要なウェル数に容量を調整します。注:細胞は、1/3 DMEMcおよび2/3 ECMを含む溶液に再懸濁されます。各ドームに対して、50μLのこの溶液が必要です。希釈ECMは安価でピペッティングが簡単です。 ウェルあたり50 μLのECM細胞懸濁液を、冷却したチップでウェルに播種し、事前に温めた24ウェルプレートに入れます。 ECMの重合のために37°C、5%CO2 インキュベーターで30分間インキュベートします。 ウェルあたり500 μLの培養液を追加します。37°C、5%CO2 インキュベーターでインキュベートし、2〜3日ごとに培地を交換します。注:オルガノイドは、i)実験、ii)3Dオルガノイド培養の維持、iii)凍結、またはiv)オルガノイド細胞単層の播種に直接使用できます(図1)。オルガノイドの増殖を顕微鏡で毎日確認し、オルガノイドを分割する最適なタイミングを選択します。オルガノイドは、明確で空の内腔と明確に定義されたエッジを持っている必要があります。内腔に黒い破片がある成熟オルガノイドは、分割に使用しないでください(図3)。 4. 3Dオルガノイド培養の維持 注:継代の場合、オルガノイドは空のルーメンで透明に見えるはずです。黒い破片は、分裂後約5日で内腔に現れ、死んだ細胞の存在を示します。継代時の死細胞数を制限することは、培養物の最適な維持のために好ましい。したがって、スケジュールは、この成熟段階に達しないように調整する必要があります。 材料の準備ECM(500 μL)のアリコートを4°Cに置き、少なくとも1時間解凍します。 24ウェルプレートを37°Cで予熱します。 10 μM Y27632 ROCK阻害剤を添加した酵素解離試薬を37°Cの水浴中で予め温めます。 培養液をRTに置きます。 無菌条件下でボンネットの下に小さな氷のバケツを置きます。 腸管3Dオルガノイドの通過P1000ピペットでこすり、ECMでオルガノイドを剥離します。培養液中でピペッティングして注意深くホモジナイズし、氷上で5 mLのコールドDMEMcを含む15 mLのコニカルチューブに移します。注:24ウェルプレートの50 μLドームで培養された12ウェルのオルガノイドを含むプールには、15 mLコニカルチューブが1本必要です。 回収したオルガノイドを500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。注:オルガノイドはチューブの底に白いペレットを形成します。遠心分離後もオルガノイドがECM内の懸濁液に残っている場合は、(ECM層に触れずに)上部上清を注意深く吸引し、P1000ピペットで10回ピペッティングしてホモジナイズし、遠心分離ステップを繰り返します。この手順の後、ECMレイヤーは表示されないはずです。 上清を注意深く吸引し、10 μM Y27632 ROCK阻害剤を添加した1 mLの予温酵素解離試薬に細胞ペレットを再懸濁します。ピペットを上下に10回動かしてオルガノイドの解離を開始します。 酵素消化のために37°Cの水浴中で5分間インキュベートします。 P1000ピペットで10回ピペッティングすることにより、オルガノイドを機械的に破壊します。顕微鏡下で細胞懸濁液を確認します。注:目的は、単離された細胞またはスモールセルクラスターを取得することです。それでも大きなオルガノイド断片が観察される場合は、インキュベーション(ステップ4.2.4)と機械的破壊(ステップ4.2.5)を繰り返します。 4 mLの氷冷DMEMcを追加します。500 x g で 4 °C で 5 分間遠心分離 上清を廃棄し、オルガノイド細胞ペレットを1 mLのDMEMcに再懸濁します。 上記のように進み(ステップ3.2.7から3.2.13)、細胞をカウントし、事前に温めた24ウェルプレートに3000個の生細胞を含む50 μLのECMドームにオルガノイド細胞を播種します。 5. 3Dオルガノイドの凍結 10S、10%DMSO、および10 μM Y27632 ROCK阻害剤を添加したDMEMcを含む凍結溶液の必要量(2つのドームのプールに1 mL)を準備し、氷上に保存します(最終的なFBS濃度は18%)。 凍結するウェルから培地を取り出します。 凍結する最初のウェルに1 mLの凍結溶液を加え、こすってECMを剥離し、ピペットチップでホモジナイズします。 オルガノイド懸濁液を凍結する第1のウェルから第2のウェルに移す。 2つのウェルのプールをクライオチューブに移し、バイアルを細胞凍結容器に入れます。 細胞凍結容器を-80°Cで24時間保管した後、バイアルを液体窒素に移して長期保存します。 6. 3Dオルガノイド由来の細胞単分子膜の培養 注:ブタオルガノイド細胞の単分子膜は、20Sを添加した3Dオルガノイドに使用される培養培地で構成される2D培地で培養されます。 材料の準備2D メディアを準備し、RT のままにします。 10 μM Y27632 ROCK阻害剤を添加した酵素解離試薬を37°Cの水浴中で予め温めます。 培養インサートのコーティングピンセットを滅菌し、バイオセーフティキャビネットに移します。 細胞培養インサート(0.33 cm2)をピンセット付きの24ウェルプレートに入れます。 冷PBSで50 μg/mLに希釈したコラーゲンIVを含むコーティング溶液を調製します。ピペットを上下に混ぜ合わせる 各細胞培養インサートに150 μLの希釈コラーゲンIV溶液(22.7 μg/cm2に相当)を追加します。注意: ピペットを透過性膜の中心に垂直に注意深く向け、コラーゲン溶液がすべての膜を覆っていることを確認します。 プレートを37°C、5%CO2 インキュベーターに入れ、一晩(または最低3時間)放置します。 細胞培養インサートへの3Dオルガノイド細胞の播種ステップ4.2.1〜4.2.7に記載されているように、3Dオルガノイドから細胞懸濁液を調製します。 トリパンブルーで1:2に希釈した細胞をセルカウンターでカウントし、培養インサートあたり2.5 x 10 5細胞を播種するのに必要な量を計算し、7.6 x 105細胞/cm2に相当します。 必要量の細胞懸濁液を500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 遠心分離中は、培養インサートからコーティング溶液を注意深く吸引し、蓋なしでフードの下のRTで5分間乾燥させます。 遠心分離後、上清を廃棄し、10 μM Y27632 ROCK阻害剤を添加した必要量の2D培地に細胞ペレットを再懸濁します。細胞を含む2D培地は、各インサートに200 μLの容量が必要です。 200 μLの細胞懸濁液(2.5 x 105 細胞)をコーティングされた透過膜(頂端側)上に播種します(図4A)。注意: 膜の中央でゆっくりとピペットをし、先端を垂直に保ちます。 10 μM Y27632 ROCK阻害剤を添加した2D培地500 μLを下部コンパートメント(基底側)に追加します。37°C、5%CO2 インキュベーターでインキュベートします。 播種の1日後に、頂端培地と基礎培地をY27632 ROCK阻害剤を含まない新鮮な2D培地と交換します。 2Dメディアは毎日交換してください。単層は播種後1日でコンフルエントになり、実験に使用できます。注:ブランク(細胞なしの挿入)の上の経上皮電気抵抗(TEER)値は、コンフルエンシーに達したことを確認します(図4B)。 7. オルガノイド細胞単分子膜の免疫染色 溶液の調製注:染色するウェルの数に応じて溶液の量を調整します。1ウェルの各ステップで200 μLの溶液が必要です。すべての商用製品への参照は、 材料表に記載されています。35 mLのPBSに5 mLの32%PFAを加えて、化学フードの下で4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液を調製します。10 mLアリコートを調製し、-20°Cで保存します。注意: ニトリル手袋を着用している間、常に化学フードの下でPFAを操作してください。 使用直前に2 μLのトリトンX100を1 mLのPBSに加えることにより、0.2%トリトンX100-PBSの溶液を調製します。RTにとどまります。 100 mgのBSAを1 mLのPBSに加えることにより、10%ウシ血清アルブミン(BSA)-PBS溶液を調製します。RTにとどまります。 1 mLのPBSに10 mgのBSAを加えて、1%BSA-PBS溶液を調製します。RTにとどまります。 995 μLの1% PBS BSAに5 μLの一次抗体を加えて、1:200で希釈したオクルジン一次抗体の溶液を調製します。溶液を氷の上に置いてください。 1%BSA-PBSの999 μLに1 μLの二次抗体を加えて、1:1,000に希釈した二次抗体の溶液を調製します。溶液を氷の上に保ち、光から保護します。 990 μLのPBSに1 mg/mLのTRITCを10 μL添加することにより、10 μg/mLのファロイジンTRITCの溶液を調製します。光から保護された氷の上に保管してください。 免疫染色注:特に明記されていない限り、すべてのインキュベーションは、ロッキングプラットフォーム(30 rpm)でゆっくりと攪拌しながら、RTで行われます。免疫染色は、細胞培養インサート内で直接行われます。基底培地と頂端培地を取り除きます。プレートを化学フードの下に置きます。 単層をRTで200 μLのPBSで2回洗浄し、5分間インキュベートします。 細胞単層を200 μLの4%PFAでRTで固定し、RTで20分間インキュベートします。 単層をRTで200 μLのPBSで2回洗浄し、5分間インキュベートします。注:固定および洗浄ステップの後、単層はPBSで4°Cに1週間保持できます。 PBSを除去し、200 μLの0.2%Triton X100-PBSで透過処理し、20分間インキュベートします。 単層をRTで200 μLのPBSで2回洗浄し、5分間インキュベートします。 200 μLの一次抗体溶液を1%BSA-PBS溶液に加え、ロッキングプラットフォームでゆっくりと攪拌しながら、4°Cで一晩インキュベートします。一次抗体を含まない1%BSA-PBSのみを添加することにより、陰性対照ウェルを含める。 単層をRTで200 μLのPBSで3回洗浄し、5分間インキュベートします。 200 μLの二次抗体を1%BSA-PBSに加え、光から保護された状態でRTで2時間インキュベートします。 単層をRTで200 μLのPBSで3回洗浄し、5分間インキュベートします。 200 μLのファロイジンTRITCを10 μg/mLで添加し、10分間インキュベートします。 単層をRTで200 μLのPBSで2回洗浄し、5分間インキュベートします。 PBSを取り外し、メスで膜を切断します。 ピンセットでメンブレンを回収し、先端側を上に向けて顕微鏡スライドの上に置きます。 DAPIを添加した封入剤15 μLを1:1,000でメンブレン上に直接加えます。カバーガラスを置き、シールします。 イメージングするまで、光から保護された4°Cで保管してください。