Patch-Clamp Kayıtları için Yenidoğan Kemirgenlerinden Vestibüler ve Spiral Ganglion Somata'nın İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi
Summary
Burada, iç kulağın vestibüler ganglion ve spiral ganglion nöronlarından diseksiyon, ayrıştırma, kültürleme ve yama-klemp kaydı için ayrıntılı talimatlar sağlayan yöntemler sunulmaktadır.
Abstract
İzole edilmiş ve kültürlenmiş iç kulak ganglion nöronlarının kompakt morfolojisi, bu popülasyondaki hücre çeşitliliğine katkıda bulunan iyon kanallarının ve nörotransmitter reseptörlerinin ayrıntılı karakterizasyonlarına izin verir. Bu protokol, yama-kelepçe kayıtları amacıyla iç kulak bipolar nöronlarının somalarının başarılı bir şekilde diseksiyonu, ayrıştırılması ve kısa süreli kültürlenmesi için gerekli adımları özetlemektedir. Vestibüler ganglion nöronlarının hazırlanması için ayrıntılı talimatlar, spiral ganglion nöronlarının kaplanması için gerekli modifikasyonlarla birlikte sağlanır. Protokol, delikli yama konfigürasyonunda tüm hücre yama kelepçesi kayıtlarını gerçekleştirmek için talimatlar içerir. Hiperpolarizasyonla aktive olan siklik nükleotid kapılı (HCN) aracılı akımların voltaj-kelepçe kayıtlarını karakterize eden örnek sonuçlar, daha standart yırtılmış yama konfigürasyonuna kıyasla delikli yama kayıt konfigürasyonunun kararlılığını vurgulamaktadır. Bu yöntemlerin kombinasyonu, izole somata artı delikli-yama-kelepçe kayıtları, uzun, kararlı kayıtlar ve G-proteinine bağlı reseptörler aracılığıyla sinyalleme gibi hücre içi ortamın korunmasını gerektiren hücresel süreçleri incelemek için kullanılabilir.
Introduction
Vestibülokoklear sinirin bipolar nöronları, iç kulağın duyusal tüy hücrelerini beyin sapına bağlar. Ses ve kafa hareketleri hakkında temel bilgi taşıyıcılarıdır; Bu önemli hücrelerin zarar görmesi sağırlık ve denge bozukluklarına yol açar. Sinirin vestibüler ve işitsel kısımlarının her biri, morfolojik ve fonksiyonel olarak farklı hücre tiplerinden oluşur 1,2. Vestibüler sistemde, iki afferent alt popülasyon, düzenli veya düzensiz aralıklarla kendiliğinden ateşlenir2. Afferent spike zamanlamasının, iyon kanalı bileşimi 3,4’teki altta yatan bir çeşitliliği yansıttığı düşünülmektedir. İşitsel sistemde, spiral ganglion nöronlarının (SGN’ler) iki ana alt popülasyonu vardır; Tip I SGN’ler tek tek iç saç hücrelerine5 temas ederken, Tip II SGN’ler birden fazla dış saç hücresinetemas eder 5. Yarı bozulmamış ve organotipik kültürlerden elde edilen in vitro kayıtlar, Tip I ve Tip II SGN’lerin membran özelliklerinde farklılıklar olduğunu göstermektedir 6,7.
Bu nöronların terminallerinde bulunan birçok iyon kanalı ve nörotransmitter reseptörü de hücre gövdelerinde bulunur. Bu nedenle, izole vestibüler ve spiral ganglion somata kültürleri, iyon kanallarının ve nörotransmitter reseptörlerinin bu nöronların tepkisine nasıl katkıda bulunduğunu anlamak için in vitro olarak incelenebilir. İzole edilmiş hücre gövdelerinin kompakt morfolojisi, voltaj kapılı iyon kanallarının ve nörotransmitter reseptörlerinin ayrıntılı karakterizasyonu için uygun olan yüksek kaliteli elektriksel kayıtlara izin verir. Temsili çeşitlilikteki nöron alt tiplerine kolay erişim, hücre çeşitliliğinin yüksek verimli analizine olanak tanır.
Bu makale, sıçanlarda postnatal günde (P)9 ila P20’de vestibüler ganglionun üst kısmından ayrışmış ganglion hücre gövdelerini izole etmek ve kültürlemek için bir yöntem sunmaktadır. Ganglion hücrelerinin başarılı bir şekilde çıkarılması, ayrıştırılması ve kaplanması için gerekli adımlara ek olarak, bu yöntemlerin spiral gangliona genişletilmesi için öneriler de sunulmaktadır. Bu yöntemler, çeşitli laboratuvarlardan 8,9,10 yayınlarda tasarlananların bir evrimidir. Bu yazıda ayrıca, yama kelepçesi kayıtları için sağlıklı hücrelerin seçilmesine yönelik rehberlik de yer almaktadır.
Son olarak, protokol, delikli yama yapılandırmasını kullanarak yama kelepçesi kaydı prosedürünü ana hatlarıyla belirtir11. Delikli yama konfigürasyonu, daha yaygın yırtılmış yama konfigürasyonundan daha fazla zaman alıcı ve teknik olarak daha zorlayıcı olsa da, uzun ve kararlı kayıt oturumlarına izin veren sitoplazmik ortamı korumak için daha iyidir. Bu kayıt konfigürasyonunun faydaları, yırtılmış yama kayıtlarına göre delikli yamadaki hiperpolarizasyonla aktive edilen katyonik akımların geliştirilmiş stabilitesi ile burada gösterilmektedir.
Bu protokol beş bölüm halinde düzenlenmiştir. Bölüm 1-3, önceden hazırlanabilecek ve depolanabilecek çözümleri ve araçları açıklar. Bölüm 4, vestibüler ve SGN’lerin diseke edilmesi ve kaplanması için adımları açıklar. Bölüm 5, kültürde bir süre sonra nöronlardan kayıt adımlarını açıklar. Bizim elimizde, bölüm 4 ve bölüm 5 art arda 2 günlük bir süre boyunca gerçekleştirilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan yöntemler, izole nöronlardan alınan kayıtlara özgüdür; Önceki çalışmalar, yarı bozulmamış bir preparatta akson terminallerinden alınan kayıtlara odaklanmıştır. Mevcut terminal kayıt teknikleriyle karşılaştırıldığında, izole kayıtlar üstün boşluk kelepçesi ve izo-potansiyel davranışı sunar. Ek olarak, bu protokol daha geniş bir nöron örneğine erişim sağlar, çünkü vestibüler epitelin yarı bozulmamış kayıtlarında yalnızca kaliks taşıyan alt popülasyonlara…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Jing Bing Xue ve Ruth Anne Eatock’a bu yöntemlere erken katkılarından dolayı teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH NIDCD R03 DC012652 ve NIH NIDCD DC012653S tarafından desteklenmiştir ve R01 RK’ya ve T32’ye DC009975 DB, NN ve KR’ye DC0155512.
Materials
| Amphotericin | Sigma-Aldrich | A4888-100MG | For perforated patch recordings. |
| ATP di-sodium | Sigma-Aldrich | A7699 | Additive to internal solution |
| B27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | additive to culture medium, for SGN |
| Beakers (1000, 100, 10) milliliter | |||
| bench-top centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | |
| Bunsen burner | |||
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | Additive to internal solution |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C5318 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22×40 | Warner Instruments | 64-0707 | |
| DMSO | Biotium | 90082 | |
| Dnase I,from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 11284932001 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Dumont #3 Forceps (Blunt) | Fine Science Tools | 11231-30 | |
| Dumont #5 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont #55 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E0396 | Additive to internal solution |
| Electrode Puller | Narashige | PC-10 | |
| Epi-illumination light source | Zeiss | CL 1500 ECO | |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | for cleaning head and around dissection bench |
| Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes | Sutter Instruments | BF140-117-10 | |
| Fine-edged dissection blade | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Glass Pasteur Pipettes | VWR | 14673-010 | to pull trituration pipettes |
| Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | additive to culture medium |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | for pH buffering all solutions in protocol |
| Hot plate / magnetic stirrers | VWR | 76549-914 | |
| Insulated bucket filled with ice | to keep all samples and solutions cool | ||
| K2SO4, Potassium Sulfate | Sigma Aldrich | P9458-250G | Additive to internal solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | P93333 | Additive to internal solution |
| KOH (1 M) | Honeywell | 319376-500ML | To bring internal solution to desired pH. |
| Large Spring Scissors | Fine Science Tools | 14133-13 | |
| Leibovitz medium | Sigma Aldrich | L4386 | dissection and bath solutions |
| Low-profile-bath recording chamber for culture dishes | Warner Instruments | 64-0236 | |
| luer-lok syringes, 30 ml | BD | 302832 | for drawing L-15/HEPES/HEPES solution. |
| MEM + Glutamax Supplement | Fisher Scientific | 41-090-101 | base of the culture medium |
| MgCl2-Hexahydrate | Sigma-Aldrich | M1028 | Additive to internal solution |
| microFil needle for filling micropipettes – 34 gauge | World Precision Instruments | MF34G | |
| Microforge | Narashige | MF-90 | For electrode polishing. |
| N2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | additiive to culture medium, for SGN |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Additive to internal solution |
| NaOH (1 M) | Thomas Scientific | 319511-500ML | for titration pH |
| Osmometer | Advanced Instruments Inc. | 3320 | |
| Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing | USC Material Management | MEDOX200 (Identifier: 00015) | for dissolving into dissection and bath solutions |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| Pasteur pipette bulb (3 ml) | Fisher Scientific | 03-448-25 | bulb for trituration pipettes |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | additive to prevent contamination of culture medium |
| Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg dosing) | MWI Animal Health | 15199 | for euthanasia |
| PES membrane filters , 0.2 micrometer | Nalgene | 566-0020 | for filtering solutions |
| PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm | CELLTREAT | 229747 | for filtering solutions drawn into syringes |
| Petri dishes, 35 x 10 mm | Genessee Scientific | 32-103 | for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration |
| Petri Dishes, 60 x 15 mm | Midland Scientific | P7455 | for gross dissection |
| pH Meter | Mettler Toledo | Model S20 | |
| Pipettors (1000, 200, 10) microliter | USA Scientific | ||
| Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish | Mattek | P35GC-0-10-C | to plate neurons for culture |
| Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes | Warner Instruments | 64-0375 | |
| Reference Cell | World Precision Instruments | RC1T | |
| Scalpel blade | Miltex | 4-315 | |
| Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scientific Scale | Mettler Toledo | XS64 | |
| Serological Pipettes (10, 25) milliliter | Fisher Scientific | ||
| Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber) | Warner Instruments | 64-0378 | |
| Small Animal Guillotine | Kent Scientific | DCAP | |
| Small animal guillotine | Kent Scientific | DCAP | for decapitation if dissecting rats older than P15. |
| Stereo Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Straight surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Syringe (3, 10, 30) milliliter | |||
| Trypsin | Sigma Aldrich | T1426 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Tuberculin syringe | Covidien | 8881500105 | for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection |
| Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Volumetric flask, 1000 milliliter | |||
| Vortex | VWR | 945300 | |
| Water, sterile u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system) | Millipore-Sigma | CDUFBI001 |
References
- Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
- Goldberg, J. M. Afferent diversity and the organization of central vestibular pathways. Experimental Brain Research. 130 (3), 277-297 (2000).
- Kalluri, R., Xue, J., Eatock, R. A. Ion channels set spike timing regularity of mammalian vestibular afferent neurons. Journal of Neurophysiology. 104 (4), 2034-2051 (2010).
- Smith, C. E., Goldberg, J. M. A stochastic afterhyperpolarizaton model of repetitive activity in vestibular afferents. Biological Cybernetics. 54 (1), 41-51 (1986).
- Berglund, A. M., Ryugo, D. K. Hair cell innervation by spiral ganglion neurons in the mouse. The Journal of Comparative Neurology. 255 (4), 560-570 (1987).
- Jagger, D. J., Housley, G. D. Membrane properties of type II spiral ganglion neurones identified in a neonatal rat cochlear slice. Journal of Physiology. 552, 525-533 (2003).
- Reid, M. A., Flores-Otero, J., Davis, R. L. Firing patterns of type II spiral ganglion neurons in vitro). The Journal of Neuroscience. 24 (3), 733-742 (2004).
- Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss. The Journal of Biological Chemistry. 285 (45), 34699-34707 (2010).
- Mo, Z. L., Davis, R. L. Endogenous firing patterns of murine spiral ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 77 (3), 1294-1305 (1997).
- Almanza, A., Luis, E., Mercado, F., Vega, R., Soto, E. Molecular identity, ontogeny, and cAMP modulation of the hyperpolarization-activated current in vestibular ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 108 (8), 2264-2275 (2012).
- Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. The Journal of General Physiology. 92 (2), 145-159 (1988).
- Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. Postsynaptic recordings at afferent dendrites contacting cochlear inner hair cells: Monitoring multivesicular release at a ribbon synapse. Journal of Visualized Experiments. (48), e2442 (2010).
- Bronson, D., Kalluri, R. Muscarinic acetylcholine receptors modulate HCN channel properties in vestibular ganglion neurons. The Journal of Neuroscience. 43 (6), 902-917 (2023).
- Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. The components of membrane conductance in the giant axon of Loligo. The Journal of Physiology. 116 (4), 473-496 (1952).
- Chabbert, C., Chambard, J. M., Valmier, J., Sans, A., Desmadryl, G. Voltage-activated sodium currents in acutely isolated mouse vestibular ganglion 17eurons. Neuroreport. 8 (5), 1253-1256 (1997).
- Bean, B. P. The action potential in mammalian central neurons. Nature Reviews. Neuroscience. 8 (6), 451-465 (2007).
- Izhikevich, E. M. . Dynamical Systems in Neuroscience. , (2018).
- Chabbert, C., Chambard, J. M., Sans, A., Desmadryl, G. Three types of depolarization-activated potassium currents in acutely isolated mouse vestibular neurons. Journal of Neurophysiology. 85 (3), 1017-1026 (2001).
- Risner, J. R., Holt, J. R. Heterogeneous potassium conductances contribute to the diverse firing properties of postnatal mouse vestibular ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2364-2376 (2006).
- Iwasaki, S., Chihara, Y., Komuta, Y., Ito, K., Sahara, Y. Low-voltage-activated potassium channels underlie the regulation of intrinsic firing properties of rat vestibular ganglion cells. Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2192-2204 (2008).
- Cervantes, B., Vega, R., Limón, A., Soto, E. Identity, expression and functional role of the sodium-activated potassium current in vestibular ganglion afferent neurons. Neuroscience. 240, 163-175 (2013).
- Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. Hyperpolarization-activated cation channels: From genes to function. Physiological Reviews. 89 (3), 847-885 (2009).
- Davis, R. L., Crozier, R. A. Dynamic firing properties of type I spiral ganglion neurons. Cell and Tissue Research. 361 (1), 115-127 (2015).
- Reijntjes, D. O. J., Pyott, S. J. The afferent signaling complex: Regulation of type I spiral ganglion neuron responses in the auditory periphery. Hearing Research. 336, 1-16 (2016).
- Eatock, R. A., Christov, F. . Ionic Conductances of Vestibular Afferent Neurons: Shaping Head Motion Signals From the Inner Ear. , (2020).
- Kalluri, R. Similarities in the biophysical properties of spiral-ganglion and vestibular-ganglion neurons in neonatal rats. Frontiers in Neuroscience. 15, 710275 (2021).
- Armstrong, C. E., Roberts, W. M. Electrical properties of frog saccular hair cells: distortion by enzymatic dissociation. The Journal of Neuroscience. 18 (8), 2962-2973 (1998).
- Rocha-Sanchez, S. M. S., et al. Developmental expression of Kcnq4 in vestibular neurons and neurosensory epithelia. Brain Research. 1139, 117-125 (2007).
- Meredith, F. L., Rennie, K. J. Zonal variations in K+ currents in vestibular crista calyx terminals. Journal of Neurophysiology. 113 (1), 264-276 (2015).
- Cai, H. Q., et al. Time-dependent activity of primary auditory neurons in the presence of neurotrophins and antibiotics. Hearing Research. 350, 122-132 (2017).
- Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O’Leary, S. J. Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents. Hearing Research. 291 (1-2), 1-14 (2012).
- Adamson, C. L., Reid, M. A., Davis, R. L. Opposite actions of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 on firing features and ion channel composition of murine spiral ganglion neurons. The Journal of Neuroscience. 22 (4), 1385-1396 (2002).
- Zhou, Z., Liu, Q., Davis, R. L. Complex regulation of spiral ganglion neuron firing patterns by neurotrophin-3. The Journal of Neuroscience. 25 (33), 7558-7566 (2005).
- Liu, X. -. P., et al. Sodium channel diversity in the vestibular ganglion: NaV1.5, NaV1.8, and tetrodotoxin-sensitive currents. Journal of Neurophysiology. 115 (5), 2536-2555 (2016).
