Summary

Isolierung und Kultivierung von vestibulären und spiralförmigen Ganglien-Somata von neonatalen Nagetieren für Patch-Clamp-Aufnahmen

Published: April 21, 2023
doi:

Summary

Hier werden Methoden vorgestellt, die detaillierte Anweisungen zum Sezieren, Dissoziieren, Kultivieren und Patch-Clamp-Aufzeichnen von vestibulären Ganglion- und Spiralganglienneuronen des Innenohrs liefern.

Abstract

Die kompakte Morphologie der isolierten und kultivierten Innenohrganglienneuronen ermöglicht eine detaillierte Charakterisierung der Ionenkanäle und Neurotransmitterrezeptoren, die zur Zellvielfalt in dieser Population beitragen. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte, die für eine erfolgreiche Sezierung, Dissoziation und Kurzzeitkultivierung der Somata von bipolaren Neuronen des Innenohrs zum Zwecke der Patch-Clamp-Aufnahme erforderlich sind. Detaillierte Anweisungen zur Präparation von vestibulären Ganglienneuronen werden mit den notwendigen Modifikationen bereitgestellt, die für die Beschichtung von Spiralganglienneuronen erforderlich sind. Das Protokoll enthält Anweisungen für die Durchführung von Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen in der perforierten Patch-Konfiguration. Beispielhafte Ergebnisse, die die Spannungsklemmenaufzeichnungen von hyperpolarisationsaktivierten zyklischen Nukleotid-gesteuerten (HCN)-vermittelten Strömen charakterisieren, unterstreichen die Stabilität der perforierten Patch-Aufzeichnungskonfiguration im Vergleich zur Standardkonfiguration mit gerissenen Patches. Die Kombination dieser Methoden, isolierte Somata und perforierte Patch-Clamp-Ableitungen, kann verwendet werden, um zelluläre Prozesse zu untersuchen, die lange, stabile Aufzeichnungen und die Erhaltung des intrazellulären Milieus erfordern, wie z. B. die Signalübertragung durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren.

Introduction

Die bipolaren Neuronen des Nervus vestibulocochlearis verbinden die sensorischen Haarzellen des Innenohrs mit dem Hirnstamm. Sie sind Hauptträger von Informationen über Schall und Kopfbewegungen; Eine Schädigung dieser wichtigen Zellen führt zu Taubheit und Gleichgewichtsstörungen. Die vestibulären und auditiven Anteile des Nervs bestehen jeweils aus unterschiedlichen Zelltypen, die morphologisch und funktionell vielfältig sind 1,2. Im vestibulären System feuern zwei afferente Subpopulationen spontan in regelmäßigen oder unregelmäßigen Abständen2. Es wird angenommen, dass das afferente Spike-Timing eine zugrundeliegende Diversität in der Zusammensetzung der Ionenkanäle widerspiegelt 3,4. Im auditorischen System gibt es zwei Hauptsubpopulationen von Spiralganglienneuronen (SGNs); Während Typ-I-SGNs mit einzelnen Innenhaarzellen5 in Kontakt treten, kontaktieren Typ-II-SGNs mehrere Außenhaarzellen5. In-vitro-Ableitungen von semi-intakten und organotypischen Kulturen deuten auf Unterschiede in den Membraneigenschaften von Typ I und Typ II SGNs hin 6,7.

Viele Ionenkanäle und Neurotransmitterrezeptoren, die sich an den Enden dieser Neuronen befinden, befinden sich auch in ihren Zellkörpern. So können Kulturen des isolierten vestibulären und des Spiralganglion-Somata in vitro untersucht werden, um zu verstehen, wie Ionenkanäle und Neurotransmitterrezeptoren zur Reaktion dieser Neuronen beitragen. Die kompakte Morphologie der isolierten Zellkörper ermöglicht qualitativ hochwertige elektrische Ableitungen, die sich für eine detaillierte Charakterisierung von spannungsabhängigen Ionenkanälen und Neurotransmitterrezeptoren eignen. Der einfache Zugang zu einer repräsentativen Vielfalt von Neuronen-Subtypen ermöglicht eine Hochdurchsatzanalyse der Zelldiversität.

In diesem Artikel wird eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von dissoziierten Ganglienzellkörpern aus dem oberen Teil des vestibulären Ganglions bei Ratten am postnatalen Tag (P)9 bis P20 vorgestellt. Es werden auch Vorschläge für die Erweiterung dieser Methoden auf das Spiralganglion gegeben, zusätzlich zu den Schritten, die für die erfolgreiche Extraktion, Dissoziation und Plattierung der Ganglienzellen erforderlich sind. Diese Methoden sind eine Weiterentwicklung derjenigen, die in Veröffentlichungen verschiedener Laboratorien entwickelt wurden 8,9,10. Dieses Dokument enthält auch eine Anleitung zur Auswahl gesunder Zellen für Patch-Clamp-Aufnahmen.

Schließlich umreißt das Protokoll das Verfahren für die Patch-Clamp-Aufzeichnung unter Verwendung der perforierten Patch-Konfiguration11. Obwohl die Konfiguration mit perforiertem Pflaster zeitaufwändiger und technisch anspruchsvoller ist als die gebräuchlichere Konfiguration mit gerissenem Pflaster, ist sie besser für die Aufrechterhaltung des zytoplasmatischen Milieus, das lange und stabile Aufnahmesitzungen ermöglicht. Die Vorteile dieser Aufzeichnungskonfiguration werden hier durch die verbesserte Stabilität von Hyperpolarisations-aktivierten kationischen Strömen in perforierten Patches im Vergleich zu ruptured-Patch-Aufnahmen veranschaulicht.

Dieses Protokoll ist in fünf Abschnitte unterteilt. In den Abschnitten 1-3 werden Lösungen und Werkzeuge beschrieben, die im Voraus vorbereitet und gespeichert werden können. Abschnitt 4 beschreibt die Schritte zur Dissektion und Beschichtung der vestibulären und SGNs. Abschnitt 5 beschreibt die Schritte zur Aufzeichnung von den Neuronen nach einer Periode in Kultur. In unseren Händen werden Abschnitt 4 und Abschnitt 5 über einen Zeitraum von 2 aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt.

Protocol

Alle hier beschriebenen Tierverwendungen wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee an der University of Southern California genehmigt. Bei den Tieren in diesem Protokoll handelt es sich um Long-Evans-Ratten beiderlei Geschlechts im Alter von P3 bis P25, die von den Charles River Laboratories bezogen wurden, aber diese Methoden können auch auf andere Nagetierstämme angewendet werden. Bei allen Eingriffen müssen Laborkittel und Handschuhe sowie bei der Herstellung von Lösungen eine Spritzschutzbrille getra…

Representative Results

Das Ausführen von Spannungsklemmprotokollen durch Anwendung von Familien von Spannungsschritten zeigt die spannungsabhängige Aktivierung einer Vielzahl unterschiedlicher Stromfamilien. Repräsentative Beispiele von Ganzzellenströmen, die von einem VGN hervorgerufen und aus veröffentlichten Aufzeichnungen13 adaptiert wurden, sind in 1A, B gezeigt. Durch das Anlegen von Depolarisationsspannungen (Abbildung 1B) wird ein …

Discussion

Die hier vorgestellten Methoden sind spezifisch für Aufzeichnungen von isolierten Neuronen; Frühere Studien konzentrierten sich auf Ableitungen von Axonendigungen in einem semi-intakten Präparat. Im Vergleich zu bestehenden Klemmenaufzeichnungstechniken bieten isolierte Aufzeichnungen ein überlegenes Raumklemmen- und Isopotentialverhalten. Darüber hinaus bietet dieses Protokoll Zugang zu einer breiteren Stichprobe von Neuronen, da nur kelchtragende Subpopulationen in semi-intakten Aufzeichnungen der vestibulären Ep…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Jing Bing Xue und Dr. Ruth Anne Eatock für ihre frühen Beiträge zu diesen Methoden. Diese Arbeit wurde von NIH NIDCD R03 DC012652 und NIH NIDCD DC012653S sowie R01 DC0155512 zu RK und T32 DC009975 zu DB, NN und KR unterstützt.

Materials

Amphotericin Sigma-Aldrich A4888-100MG For perforated patch recordings.
ATP di-sodium Sigma-Aldrich A7699 Additive to internal solution
B27 Supplement (50x), serum free Thermo Fisher Scientific 17504044 additive to culture medium, for SGN
Beakers (1000, 100, 10) milliliter
bench-top centrifuge USA Scientific 2641-0016
Bunsen burner
CaCl2 J.T. Baker 1311-01 Additive to internal solution
Collagenase Sigma-Aldrich C5318 one out of three enzyme to digest tissue
Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22×40  Warner Instruments 64-0707
DMSO Biotium 90082
Dnase I,from bovine pancreas Sigma-Aldrich 11284932001 one out of three enzyme to digest tissue
Dumont #3 Forceps (Blunt) Fine Science Tools 11231-30
Dumont #5 Forceps (Fine) Fine Science Tools 11251-10
Dumont #55 Forceps (Fine) Fine Science Tools 11255-20
EGTA Sigma-Aldrich E0396 Additive to internal solution
Electrode Puller Narashige PC-10
Epi-illumination light source  Zeiss  CL 1500 ECO
Ethanol Decon Labs 2716 for cleaning head and around dissection bench
Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes Sutter Instruments BF140-117-10
Fine-edged dissection blade Fine Science Tools 10010-00
Glass Pasteur Pipettes VWR 14673-010 to pull trituration pipettes
Heat-inactivated Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16140063 additive to culture medium
HEPES Sigma-Aldrich H3375-100G for pH buffering all solutions in protocol
Hot plate / magnetic stirrers  VWR 76549-914
Insulated bucket filled with ice to keep all samples and solutions cool
K2SO4, Potassium Sulfate Sigma Aldrich P9458-250G Additive to internal solution
KCl Sigma-Aldrich P93333 Additive to internal solution
KOH (1 M) Honeywell 319376-500ML To bring internal solution to desired pH.
Large Spring Scissors Fine Science Tools 14133-13
Leibovitz medium  Sigma Aldrich L4386 dissection and bath solutions 
Low-profile-bath recording chamber for culture dishes Warner Instruments 64-0236
luer-lok syringes, 30 ml BD 302832 for drawing L-15/HEPES/HEPES solution.
MEM + Glutamax Supplement Fisher Scientific 41-090-101 base of the culture medium
MgCl2-Hexahydrate Sigma-Aldrich M1028 Additive to internal solution
microFil needle for filling micropipettes – 34 gauge  World Precision Instruments MF34G
Microforge Narashige MF-90 For electrode polishing.
N2 Supplement (100x) Thermo Fisher Scientific 17502-048 additiive to culture medium, for SGN
NaCl Sigma-Aldrich S7653 Additive to internal solution
NaOH (1 M) Thomas Scientific 319511-500ML for titration pH
Osmometer Advanced Instruments Inc. 3320
Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing USC Material Management MEDOX200 (Identifier: 00015) for dissolving into dissection and bath solutions
Parafilm Bemis PM992
Pasteur pipette bulb (3 ml) Fisher Scientific 03-448-25 bulb for trituration pipettes
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 additive to prevent contamination of culture medium
Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg dosing)  MWI Animal Health 15199 for euthanasia
PES membrane filters ,  0.2 micrometer  Nalgene 566-0020 for filtering solutions
PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm  CELLTREAT 229747 for filtering solutions drawn into syringes
Petri dishes, 35 x 10 mm Genessee Scientific 32-103 for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration
Petri Dishes, 60 x 15 mm Midland Scientific P7455 for gross dissection
pH Meter Mettler Toledo Model S20
Pipettors (1000, 200, 10) microliter USA Scientific
Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish Mattek P35GC-0-10-C to plate neurons for culture
Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes Warner Instruments 64-0375
Reference Cell World Precision Instruments RC1T
Scalpel blade Miltex 4-315
Scalpel Handle Fine Science Tools 10003-12
Scientific Scale Mettler Toledo XS64
Serological Pipettes (10, 25) milliliter Fisher Scientific
Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber) Warner Instruments 64-0378
Small Animal Guillotine Kent Scientific DCAP
Small animal guillotine Kent Scientific DCAP for decapitation if dissecting rats older than P15.
Stereo Dissection Microscope  Zeiss Stemi 2000
Straight surgical scissors Fine Science Tools 14060-09
Syringe (3, 10, 30) milliliter
Trypsin Sigma Aldrich T1426 one out of three enzyme to digest tissue
Tuberculin syringe  Covidien 8881500105 for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection
Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge Fine Science Tools 15000-08
Volumetric flask, 1000 milliliter
Vortex VWR 945300
Water, sterile u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system) Millipore-Sigma CDUFBI001

References

  1. Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
  2. Goldberg, J. M. Afferent diversity and the organization of central vestibular pathways. Experimental Brain Research. 130 (3), 277-297 (2000).
  3. Kalluri, R., Xue, J., Eatock, R. A. Ion channels set spike timing regularity of mammalian vestibular afferent neurons. Journal of Neurophysiology. 104 (4), 2034-2051 (2010).
  4. Smith, C. E., Goldberg, J. M. A stochastic afterhyperpolarizaton model of repetitive activity in vestibular afferents. Biological Cybernetics. 54 (1), 41-51 (1986).
  5. Berglund, A. M., Ryugo, D. K. Hair cell innervation by spiral ganglion neurons in the mouse. The Journal of Comparative Neurology. 255 (4), 560-570 (1987).
  6. Jagger, D. J., Housley, G. D. Membrane properties of type II spiral ganglion neurones identified in a neonatal rat cochlear slice. Journal of Physiology. 552, 525-533 (2003).
  7. Reid, M. A., Flores-Otero, J., Davis, R. L. Firing patterns of type II spiral ganglion neurons in vitro). The Journal of Neuroscience. 24 (3), 733-742 (2004).
  8. Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss. The Journal of Biological Chemistry. 285 (45), 34699-34707 (2010).
  9. Mo, Z. L., Davis, R. L. Endogenous firing patterns of murine spiral ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 77 (3), 1294-1305 (1997).
  10. Almanza, A., Luis, E., Mercado, F., Vega, R., Soto, E. Molecular identity, ontogeny, and cAMP modulation of the hyperpolarization-activated current in vestibular ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 108 (8), 2264-2275 (2012).
  11. Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. The Journal of General Physiology. 92 (2), 145-159 (1988).
  12. Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. Postsynaptic recordings at afferent dendrites contacting cochlear inner hair cells: Monitoring multivesicular release at a ribbon synapse. Journal of Visualized Experiments. (48), e2442 (2010).
  13. Bronson, D., Kalluri, R. Muscarinic acetylcholine receptors modulate HCN channel properties in vestibular ganglion neurons. The Journal of Neuroscience. 43 (6), 902-917 (2023).
  14. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. The components of membrane conductance in the giant axon of Loligo. The Journal of Physiology. 116 (4), 473-496 (1952).
  15. Chabbert, C., Chambard, J. M., Valmier, J., Sans, A., Desmadryl, G. Voltage-activated sodium currents in acutely isolated mouse vestibular ganglion 17eurons. Neuroreport. 8 (5), 1253-1256 (1997).
  16. Bean, B. P. The action potential in mammalian central neurons. Nature Reviews. Neuroscience. 8 (6), 451-465 (2007).
  17. Izhikevich, E. M. . Dynamical Systems in Neuroscience. , (2018).
  18. Chabbert, C., Chambard, J. M., Sans, A., Desmadryl, G. Three types of depolarization-activated potassium currents in acutely isolated mouse vestibular neurons. Journal of Neurophysiology. 85 (3), 1017-1026 (2001).
  19. Risner, J. R., Holt, J. R. Heterogeneous potassium conductances contribute to the diverse firing properties of postnatal mouse vestibular ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2364-2376 (2006).
  20. Iwasaki, S., Chihara, Y., Komuta, Y., Ito, K., Sahara, Y. Low-voltage-activated potassium channels underlie the regulation of intrinsic firing properties of rat vestibular ganglion cells. Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2192-2204 (2008).
  21. Cervantes, B., Vega, R., Limón, A., Soto, E. Identity, expression and functional role of the sodium-activated potassium current in vestibular ganglion afferent neurons. Neuroscience. 240, 163-175 (2013).
  22. Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. Hyperpolarization-activated cation channels: From genes to function. Physiological Reviews. 89 (3), 847-885 (2009).
  23. Davis, R. L., Crozier, R. A. Dynamic firing properties of type I spiral ganglion neurons. Cell and Tissue Research. 361 (1), 115-127 (2015).
  24. Reijntjes, D. O. J., Pyott, S. J. The afferent signaling complex: Regulation of type I spiral ganglion neuron responses in the auditory periphery. Hearing Research. 336, 1-16 (2016).
  25. Eatock, R. A., Christov, F. . Ionic Conductances of Vestibular Afferent Neurons: Shaping Head Motion Signals From the Inner Ear. , (2020).
  26. Kalluri, R. Similarities in the biophysical properties of spiral-ganglion and vestibular-ganglion neurons in neonatal rats. Frontiers in Neuroscience. 15, 710275 (2021).
  27. Armstrong, C. E., Roberts, W. M. Electrical properties of frog saccular hair cells: distortion by enzymatic dissociation. The Journal of Neuroscience. 18 (8), 2962-2973 (1998).
  28. Rocha-Sanchez, S. M. S., et al. Developmental expression of Kcnq4 in vestibular neurons and neurosensory epithelia. Brain Research. 1139, 117-125 (2007).
  29. Meredith, F. L., Rennie, K. J. Zonal variations in K+ currents in vestibular crista calyx terminals. Journal of Neurophysiology. 113 (1), 264-276 (2015).
  30. Cai, H. Q., et al. Time-dependent activity of primary auditory neurons in the presence of neurotrophins and antibiotics. Hearing Research. 350, 122-132 (2017).
  31. Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O’Leary, S. J. Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents. Hearing Research. 291 (1-2), 1-14 (2012).
  32. Adamson, C. L., Reid, M. A., Davis, R. L. Opposite actions of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 on firing features and ion channel composition of murine spiral ganglion neurons. The Journal of Neuroscience. 22 (4), 1385-1396 (2002).
  33. Zhou, Z., Liu, Q., Davis, R. L. Complex regulation of spiral ganglion neuron firing patterns by neurotrophin-3. The Journal of Neuroscience. 25 (33), 7558-7566 (2005).
  34. Liu, X. -. P., et al. Sodium channel diversity in the vestibular ganglion: NaV1.5, NaV1.8, and tetrodotoxin-sensitive currents. Journal of Neurophysiology. 115 (5), 2536-2555 (2016).

Play Video

Cite This Article
Iyer, M. R., Ventura, C., Bronson, D., Nowak, N., Regalado, K., Kalluri, R. Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (194), e64908, doi:10.3791/64908 (2023).

View Video