パッチクランプ記録のための新生児げっ歯類からの前庭およびらせん状神経節体細胞の分離と培養

前庭蝸牛神経の双極ニューロンは、内耳の感覚有毛細胞を脳幹に接続します。それらは、音と頭の動きに関する情報の主要な担い手です。これらの重要な細胞の損傷は、難聴や平衡障害につながります。神経の前庭部分と聴覚部分は、それぞれ形態学的および機能的に多様な異なる細胞タイプで構成されています^1,2。前庭系では、2つの求心性亜集団が規則的または不規則な間隔で自発的に発火する²。求心性スパイクのタイミングは、イオンチャネル組成の根本的な多様性を反映していると考えられている^3,4。聴覚系には、らせん神経節ニューロン(SGN)の2つの主要な亜集団があります。一方、I型SGNは個々の内有毛細胞に接触し⁵、II型SGNは複数の外有毛細胞⁵に接触する。セミインタクト培養および器官型培養からのin vitro記録は、I型SGN^とII型SGNの膜特性の違いを示唆しています^6,7。

これらのニューロンの末端に見られる多くのイオンチャネルと神経伝達物質受容体は、それらの細胞体にも見られます。そのため、単離された前庭およびらせん神経節体細胞の培養を in vitro で研究して、イオンチャネルと神経伝達物質受容体がこれらのニューロンの応答にどのように寄与するかを理解することができます。単離された細胞体のコンパクトな形態により、電位依存性イオンチャネルや神経伝達物質受容体の詳細な特性評価に適した高品質の電気記録が可能になります。代表的なニューロンサブタイプに簡単にアクセスできるため、細胞多様性のハイスループット解析が可能です。

本稿では、ラットの出生後(P)9〜P20に、前庭神経節の上層部から解離した神経節細胞体を単離して培養する方法を紹介します。また、神経節細胞の抽出、解離、およびプレーティングを成功させるために必要なステップに加えて、これらの方法をらせん状神経節に拡張するための提案も提供されています。これらの方法は、さまざまな研究所の出版物で考案された方法の進化形です^8,9,10。また、この論文には、パッチクランプ記録用の健康な細胞を選択するためのガイダンスも含まれています。

最後に、プロトコルは、穿孔パッチ構成¹¹を使用したパッチクランプ記録の手順を概説する。穿孔パッチ構成は、より一般的な破裂パッチ構成よりも時間がかかり、技術的にも困難ですが、細胞質環境を維持するのに優れているため、長時間安定した記録セッションが可能です。この記録構成の利点は、破裂パッチ記録と比較して、穴あきパッチの過分極活性化カチオン電流の安定性が向上することで示されています。

このプロトコルは 5 つのセクションに分かれています。セクション 1 から 3 では、事前に準備して保存できるソリューションとツールについて説明します。セクション4では、前庭およびSGNを解剖およびプレーティングするステップについて説明し、セクション5では、培養期間後のニューロンから記録するステップを説明します。私たちの手では、セクション4とセクション5は2日間連続して実行されます。