Summary

عزل وزراعة العقدة الدهليزية والحلزونية من القوارض الوليدية لتسجيلات المشبك الرقعي

Published: April 21, 2023
doi:

Summary

تظهر هنا طرق توفر تعليمات مفصلة لتشريح وفصل وزراعة وتسجيل المشبك التصحيحي من العقدة الدهليزية والخلايا العصبية العقدية الحلزونية في الأذن الداخلية.

Abstract

يسمح التشكل المضغوط للخلايا العصبية العقدية المعزولة والمستزرعة في الأذن الداخلية بتوصيف مفصل للقنوات الأيونية ومستقبلات الناقل العصبي التي تساهم في تنوع الخلايا عبر هذه الفئة من السكان. يحدد هذا البروتوكول الخطوات اللازمة لنجاح تشريح وفصل وزراعة قصيرة الأجل للسوماتا من الخلايا العصبية ثنائية القطب في الأذن الداخلية لغرض تسجيلات المشبك الرقعة. يتم توفير تعليمات مفصلة لإعداد الخلايا العصبية العقدة الدهليزية مع التعديلات اللازمة اللازمة لطلاء الخلايا العصبية العقدية الحلزونية. يتضمن البروتوكول تعليمات لإجراء تسجيلات مشبك التصحيح للخلية بالكامل في تكوين التصحيح المثقوب. مثال على النتائج التي تميز تسجيلات مشبك الجهد للتيارات بوساطة النيوكليوتيدات الحلقية المنشطة بفرط الاستقطاب (HCN) تسلط الضوء على استقرار تكوين تسجيل التصحيح المثقوب مقارنة بتكوين الرقعة الممزقة القياسية. يمكن استخدام مزيج من هذه الطرق ، سوماتا معزولة بالإضافة إلى تسجيلات مشبك رقعة مثقبة ، لدراسة العمليات الخلوية التي تتطلب تسجيلات طويلة ومستقرة والحفاظ على البيئة داخل الخلايا ، مثل الإشارات من خلال مستقبلات البروتين G.

Introduction

تربط الخلايا العصبية ثنائية القطب في العصب الدهليزي القوقعي خلايا الشعر الحسية للأذن الداخلية بجذع الدماغ. هم الناقلون الرئيسيون للمعلومات حول الصوت وحركات الرأس. الأضرار التي لحقت هذه الخلايا الهامة يؤدي إلى الصمم واضطرابات التوازن. تتكون الأجزاء الدهليزية والسمعية من العصب من أنواع خلايا متميزة متنوعة شكليا ووظيفيا 1,2. في النظام الدهليزي ، تطلق مجموعتان فرعيتان واردتان تلقائيا على فترات منتظمة أو غير منتظمة2. يعتقد أن توقيت ارتفاع الوارد يعكس تنوعا أساسيا في تكوين القناة الأيونية 3,4. في النظام السمعي ، هناك نوعان من المجموعات الفرعية الرئيسية للخلايا العصبية العقدية الحلزونية (SGNs) ؛ في حين أن النوع الأول من SGNs يتصل بخلايا الشعر الداخلية الفردية5 ، فإن النوع الثاني من SGNs يتصل بخلايا شعرية خارجية متعددة5. تشير التسجيلات في المختبر من الثقافات شبه السليمة والأنماط العضوية إلى اختلافات في خصائص الغشاء للنوع الأول والنوع الثاني SGNs 6,7.

توجد أيضا العديد من القنوات الأيونية ومستقبلات الناقلات العصبية الموجودة في أطراف هذه الخلايا العصبية في أجسامها الخلوية. على هذا النحو ، يمكن دراسة ثقافات العقدة الجسدية الدهليزية والحلزونية المعزولة في المختبر لفهم كيفية مساهمة القنوات الأيونية ومستقبلات الناقل العصبي في استجابة هذه الخلايا العصبية. يسمح التشكل المضغوط لأجسام الخلايا المعزولة بتسجيلات كهربائية عالية الجودة ، ومناسبة للتوصيف التفصيلي للقنوات الأيونية ذات الجهد الكهربائي ومستقبلات الناقل العصبي. يسمح الوصول السهل إلى مجموعة متنوعة تمثيلية من الأنواع الفرعية للخلايا العصبية بإجراء تحليل عالي الإنتاجية لتنوع الخلايا.

تقدم هذه المقالة طريقة لعزل وزراعة أجسام الخلايا العقدية المنفصلة عن الجزء العلوي من العقدة الدهليزية في الفئران في يوم ما بعد الولادة (P) 9 إلى P20. كما يتم تقديم اقتراحات لتوسيع هذه الطرق لتشمل العقدة الحلزونية ، بالإضافة إلى الخطوات المطلوبة لاستخراج الخلايا العقدية وفصلها وطلائها بنجاح. هذه الأساليب هي تطور لتلك التي تم ابتكارها في المنشورات من مختلف المختبرات8،9،10. تتضمن هذه الورقة أيضا إرشادات لاختيار الخلايا السليمة لتسجيلات المشبك الرقعي.

أخيرا ، يحدد البروتوكول إجراء تسجيل مشبك التصحيح باستخدام تكوين التصحيحالمثقب 11. على الرغم من أن تكوين التصحيح المثقوب يستغرق وقتا أطول وأكثر تحديا من الناحية الفنية من تكوين التصحيح الممزق الأكثر شيوعا ، إلا أنه أفضل للحفاظ على بيئة السيتوبلازم التي تسمح بجلسات تسجيل طويلة ومستقرة. تتضح فوائد تكوين التسجيل هذا هنا من خلال تحسين استقرار التيارات الكاتيونية المنشطة بفرط الاستقطاب في الرقعة المثقبة بالنسبة إلى تسجيلات التصحيح الممزق.

تم تنظيم هذا البروتوكول في خمسة أقسام. تصف الأقسام 1-3 الحلول والأدوات التي يمكن إعدادها وتخزينها مسبقا. يصف القسم 4 خطوات تشريح وطلاء الدهليزي و SGNs. يصف القسم 5 خطوات التسجيل من الخلايا العصبية بعد فترة في الثقافة. في أيدينا ، يتم تنفيذ القسم 4 والقسم 5 على مدى 2 أيام متتالية.

Protocol

تمت الموافقة على جميع استخدامات الموصوفة هنا من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية في جامعة جنوب كاليفورنيا. في هذا البروتوكول هي فئران Long Evans التي تتراوح أعمارها بين P3 و P25 من كلا الجنسين والتي تم الحصول عليها من مختبرات Charles River ، ولكن يمكن تطبيق هذه الطرق على سلالات القوارض الأخرى. يجب ارتد?…

Representative Results

يكشف تشغيل بروتوكولات مشبك الجهد عن طريق تطبيق عائلات خطوات الجهد عن التنشيط المعتمد على الجهد لمجموعة متنوعة من عائلات التيارات المختلفة. يتم عرض أمثلة تمثيلية لتيارات الخلية الكاملة المستثارة من VGN والمقتبسة من التسجيلات المنشورة13 في الشكل 1A ، B. ي…

Discussion

الطرق المعروضة هنا خاصة بالتسجيلات من الخلايا العصبية المعزولة. ركزت الدراسات السابقة على التسجيلات من المحطات المحورية في إعداد شبه سليم. عند مقارنتها بتقنيات التسجيل الطرفية الحالية ، توفر التسجيلات المعزولة سلوكا فائقا لمشبك الفضاء وجهدا متساويا. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر هذا البروتوك…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نحن نقدر الدكتور جينغ بينغ شيويه وروث آن إيتوك لمساهماتهما المبكرة في هذه الأساليب. تم دعم هذا العمل من قبل NIH NIDCD R03 DC012652 و NIH NIDCD DC012653S ، و R01 DC0155512 إلى RK و T32 DC009975 إلى DB و NN و KR.

Materials

Amphotericin Sigma-Aldrich A4888-100MG For perforated patch recordings.
ATP di-sodium Sigma-Aldrich A7699 Additive to internal solution
B27 Supplement (50x), serum free Thermo Fisher Scientific 17504044 additive to culture medium, for SGN
Beakers (1000, 100, 10) milliliter
bench-top centrifuge USA Scientific 2641-0016
Bunsen burner
CaCl2 J.T. Baker 1311-01 Additive to internal solution
Collagenase Sigma-Aldrich C5318 one out of three enzyme to digest tissue
Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22×40  Warner Instruments 64-0707
DMSO Biotium 90082
Dnase I,from bovine pancreas Sigma-Aldrich 11284932001 one out of three enzyme to digest tissue
Dumont #3 Forceps (Blunt) Fine Science Tools 11231-30
Dumont #5 Forceps (Fine) Fine Science Tools 11251-10
Dumont #55 Forceps (Fine) Fine Science Tools 11255-20
EGTA Sigma-Aldrich E0396 Additive to internal solution
Electrode Puller Narashige PC-10
Epi-illumination light source  Zeiss  CL 1500 ECO
Ethanol Decon Labs 2716 for cleaning head and around dissection bench
Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes Sutter Instruments BF140-117-10
Fine-edged dissection blade Fine Science Tools 10010-00
Glass Pasteur Pipettes VWR 14673-010 to pull trituration pipettes
Heat-inactivated Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 16140063 additive to culture medium
HEPES Sigma-Aldrich H3375-100G for pH buffering all solutions in protocol
Hot plate / magnetic stirrers  VWR 76549-914
Insulated bucket filled with ice to keep all samples and solutions cool
K2SO4, Potassium Sulfate Sigma Aldrich P9458-250G Additive to internal solution
KCl Sigma-Aldrich P93333 Additive to internal solution
KOH (1 M) Honeywell 319376-500ML To bring internal solution to desired pH.
Large Spring Scissors Fine Science Tools 14133-13
Leibovitz medium  Sigma Aldrich L4386 dissection and bath solutions 
Low-profile-bath recording chamber for culture dishes Warner Instruments 64-0236
luer-lok syringes, 30 ml BD 302832 for drawing L-15/HEPES/HEPES solution.
MEM + Glutamax Supplement Fisher Scientific 41-090-101 base of the culture medium
MgCl2-Hexahydrate Sigma-Aldrich M1028 Additive to internal solution
microFil needle for filling micropipettes – 34 gauge  World Precision Instruments MF34G
Microforge Narashige MF-90 For electrode polishing.
N2 Supplement (100x) Thermo Fisher Scientific 17502-048 additiive to culture medium, for SGN
NaCl Sigma-Aldrich S7653 Additive to internal solution
NaOH (1 M) Thomas Scientific 319511-500ML for titration pH
Osmometer Advanced Instruments Inc. 3320
Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing USC Material Management MEDOX200 (Identifier: 00015) for dissolving into dissection and bath solutions
Parafilm Bemis PM992
Pasteur pipette bulb (3 ml) Fisher Scientific 03-448-25 bulb for trituration pipettes
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 additive to prevent contamination of culture medium
Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg dosing)  MWI Animal Health 15199 for euthanasia
PES membrane filters ,  0.2 micrometer  Nalgene 566-0020 for filtering solutions
PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm  CELLTREAT 229747 for filtering solutions drawn into syringes
Petri dishes, 35 x 10 mm Genessee Scientific 32-103 for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration
Petri Dishes, 60 x 15 mm Midland Scientific P7455 for gross dissection
pH Meter Mettler Toledo Model S20
Pipettors (1000, 200, 10) microliter USA Scientific
Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish Mattek P35GC-0-10-C to plate neurons for culture
Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes Warner Instruments 64-0375
Reference Cell World Precision Instruments RC1T
Scalpel blade Miltex 4-315
Scalpel Handle Fine Science Tools 10003-12
Scientific Scale Mettler Toledo XS64
Serological Pipettes (10, 25) milliliter Fisher Scientific
Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber) Warner Instruments 64-0378
Small Animal Guillotine Kent Scientific DCAP
Small animal guillotine Kent Scientific DCAP for decapitation if dissecting rats older than P15.
Stereo Dissection Microscope  Zeiss Stemi 2000
Straight surgical scissors Fine Science Tools 14060-09
Syringe (3, 10, 30) milliliter
Trypsin Sigma Aldrich T1426 one out of three enzyme to digest tissue
Tuberculin syringe  Covidien 8881500105 for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection
Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge Fine Science Tools 15000-08
Volumetric flask, 1000 milliliter
Vortex VWR 945300
Water, sterile u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system) Millipore-Sigma CDUFBI001

References

  1. Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
  2. Goldberg, J. M. Afferent diversity and the organization of central vestibular pathways. Experimental Brain Research. 130 (3), 277-297 (2000).
  3. Kalluri, R., Xue, J., Eatock, R. A. Ion channels set spike timing regularity of mammalian vestibular afferent neurons. Journal of Neurophysiology. 104 (4), 2034-2051 (2010).
  4. Smith, C. E., Goldberg, J. M. A stochastic afterhyperpolarizaton model of repetitive activity in vestibular afferents. Biological Cybernetics. 54 (1), 41-51 (1986).
  5. Berglund, A. M., Ryugo, D. K. Hair cell innervation by spiral ganglion neurons in the mouse. The Journal of Comparative Neurology. 255 (4), 560-570 (1987).
  6. Jagger, D. J., Housley, G. D. Membrane properties of type II spiral ganglion neurones identified in a neonatal rat cochlear slice. Journal of Physiology. 552, 525-533 (2003).
  7. Reid, M. A., Flores-Otero, J., Davis, R. L. Firing patterns of type II spiral ganglion neurons in vitro). The Journal of Neuroscience. 24 (3), 733-742 (2004).
  8. Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss. The Journal of Biological Chemistry. 285 (45), 34699-34707 (2010).
  9. Mo, Z. L., Davis, R. L. Endogenous firing patterns of murine spiral ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 77 (3), 1294-1305 (1997).
  10. Almanza, A., Luis, E., Mercado, F., Vega, R., Soto, E. Molecular identity, ontogeny, and cAMP modulation of the hyperpolarization-activated current in vestibular ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 108 (8), 2264-2275 (2012).
  11. Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. The Journal of General Physiology. 92 (2), 145-159 (1988).
  12. Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. Postsynaptic recordings at afferent dendrites contacting cochlear inner hair cells: Monitoring multivesicular release at a ribbon synapse. Journal of Visualized Experiments. (48), e2442 (2010).
  13. Bronson, D., Kalluri, R. Muscarinic acetylcholine receptors modulate HCN channel properties in vestibular ganglion neurons. The Journal of Neuroscience. 43 (6), 902-917 (2023).
  14. Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. The components of membrane conductance in the giant axon of Loligo. The Journal of Physiology. 116 (4), 473-496 (1952).
  15. Chabbert, C., Chambard, J. M., Valmier, J., Sans, A., Desmadryl, G. Voltage-activated sodium currents in acutely isolated mouse vestibular ganglion 17eurons. Neuroreport. 8 (5), 1253-1256 (1997).
  16. Bean, B. P. The action potential in mammalian central neurons. Nature Reviews. Neuroscience. 8 (6), 451-465 (2007).
  17. Izhikevich, E. M. . Dynamical Systems in Neuroscience. , (2018).
  18. Chabbert, C., Chambard, J. M., Sans, A., Desmadryl, G. Three types of depolarization-activated potassium currents in acutely isolated mouse vestibular neurons. Journal of Neurophysiology. 85 (3), 1017-1026 (2001).
  19. Risner, J. R., Holt, J. R. Heterogeneous potassium conductances contribute to the diverse firing properties of postnatal mouse vestibular ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2364-2376 (2006).
  20. Iwasaki, S., Chihara, Y., Komuta, Y., Ito, K., Sahara, Y. Low-voltage-activated potassium channels underlie the regulation of intrinsic firing properties of rat vestibular ganglion cells. Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2192-2204 (2008).
  21. Cervantes, B., Vega, R., Limón, A., Soto, E. Identity, expression and functional role of the sodium-activated potassium current in vestibular ganglion afferent neurons. Neuroscience. 240, 163-175 (2013).
  22. Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. Hyperpolarization-activated cation channels: From genes to function. Physiological Reviews. 89 (3), 847-885 (2009).
  23. Davis, R. L., Crozier, R. A. Dynamic firing properties of type I spiral ganglion neurons. Cell and Tissue Research. 361 (1), 115-127 (2015).
  24. Reijntjes, D. O. J., Pyott, S. J. The afferent signaling complex: Regulation of type I spiral ganglion neuron responses in the auditory periphery. Hearing Research. 336, 1-16 (2016).
  25. Eatock, R. A., Christov, F. . Ionic Conductances of Vestibular Afferent Neurons: Shaping Head Motion Signals From the Inner Ear. , (2020).
  26. Kalluri, R. Similarities in the biophysical properties of spiral-ganglion and vestibular-ganglion neurons in neonatal rats. Frontiers in Neuroscience. 15, 710275 (2021).
  27. Armstrong, C. E., Roberts, W. M. Electrical properties of frog saccular hair cells: distortion by enzymatic dissociation. The Journal of Neuroscience. 18 (8), 2962-2973 (1998).
  28. Rocha-Sanchez, S. M. S., et al. Developmental expression of Kcnq4 in vestibular neurons and neurosensory epithelia. Brain Research. 1139, 117-125 (2007).
  29. Meredith, F. L., Rennie, K. J. Zonal variations in K+ currents in vestibular crista calyx terminals. Journal of Neurophysiology. 113 (1), 264-276 (2015).
  30. Cai, H. Q., et al. Time-dependent activity of primary auditory neurons in the presence of neurotrophins and antibiotics. Hearing Research. 350, 122-132 (2017).
  31. Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O’Leary, S. J. Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents. Hearing Research. 291 (1-2), 1-14 (2012).
  32. Adamson, C. L., Reid, M. A., Davis, R. L. Opposite actions of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 on firing features and ion channel composition of murine spiral ganglion neurons. The Journal of Neuroscience. 22 (4), 1385-1396 (2002).
  33. Zhou, Z., Liu, Q., Davis, R. L. Complex regulation of spiral ganglion neuron firing patterns by neurotrophin-3. The Journal of Neuroscience. 25 (33), 7558-7566 (2005).
  34. Liu, X. -. P., et al. Sodium channel diversity in the vestibular ganglion: NaV1.5, NaV1.8, and tetrodotoxin-sensitive currents. Journal of Neurophysiology. 115 (5), 2536-2555 (2016).

Play Video

Cite This Article
Iyer, M. R., Ventura, C., Bronson, D., Nowak, N., Regalado, K., Kalluri, R. Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (194), e64908, doi:10.3791/64908 (2023).

View Video