عزل وزراعة العقدة الدهليزية والحلزونية من القوارض الوليدية لتسجيلات المشبك الرقعي
Summary
تظهر هنا طرق توفر تعليمات مفصلة لتشريح وفصل وزراعة وتسجيل المشبك التصحيحي من العقدة الدهليزية والخلايا العصبية العقدية الحلزونية في الأذن الداخلية.
Abstract
يسمح التشكل المضغوط للخلايا العصبية العقدية المعزولة والمستزرعة في الأذن الداخلية بتوصيف مفصل للقنوات الأيونية ومستقبلات الناقل العصبي التي تساهم في تنوع الخلايا عبر هذه الفئة من السكان. يحدد هذا البروتوكول الخطوات اللازمة لنجاح تشريح وفصل وزراعة قصيرة الأجل للسوماتا من الخلايا العصبية ثنائية القطب في الأذن الداخلية لغرض تسجيلات المشبك الرقعة. يتم توفير تعليمات مفصلة لإعداد الخلايا العصبية العقدة الدهليزية مع التعديلات اللازمة اللازمة لطلاء الخلايا العصبية العقدية الحلزونية. يتضمن البروتوكول تعليمات لإجراء تسجيلات مشبك التصحيح للخلية بالكامل في تكوين التصحيح المثقوب. مثال على النتائج التي تميز تسجيلات مشبك الجهد للتيارات بوساطة النيوكليوتيدات الحلقية المنشطة بفرط الاستقطاب (HCN) تسلط الضوء على استقرار تكوين تسجيل التصحيح المثقوب مقارنة بتكوين الرقعة الممزقة القياسية. يمكن استخدام مزيج من هذه الطرق ، سوماتا معزولة بالإضافة إلى تسجيلات مشبك رقعة مثقبة ، لدراسة العمليات الخلوية التي تتطلب تسجيلات طويلة ومستقرة والحفاظ على البيئة داخل الخلايا ، مثل الإشارات من خلال مستقبلات البروتين G.
Introduction
تربط الخلايا العصبية ثنائية القطب في العصب الدهليزي القوقعي خلايا الشعر الحسية للأذن الداخلية بجذع الدماغ. هم الناقلون الرئيسيون للمعلومات حول الصوت وحركات الرأس. الأضرار التي لحقت هذه الخلايا الهامة يؤدي إلى الصمم واضطرابات التوازن. تتكون الأجزاء الدهليزية والسمعية من العصب من أنواع خلايا متميزة متنوعة شكليا ووظيفيا 1,2. في النظام الدهليزي ، تطلق مجموعتان فرعيتان واردتان تلقائيا على فترات منتظمة أو غير منتظمة2. يعتقد أن توقيت ارتفاع الوارد يعكس تنوعا أساسيا في تكوين القناة الأيونية 3,4. في النظام السمعي ، هناك نوعان من المجموعات الفرعية الرئيسية للخلايا العصبية العقدية الحلزونية (SGNs) ؛ في حين أن النوع الأول من SGNs يتصل بخلايا الشعر الداخلية الفردية5 ، فإن النوع الثاني من SGNs يتصل بخلايا شعرية خارجية متعددة5. تشير التسجيلات في المختبر من الثقافات شبه السليمة والأنماط العضوية إلى اختلافات في خصائص الغشاء للنوع الأول والنوع الثاني SGNs 6,7.
توجد أيضا العديد من القنوات الأيونية ومستقبلات الناقلات العصبية الموجودة في أطراف هذه الخلايا العصبية في أجسامها الخلوية. على هذا النحو ، يمكن دراسة ثقافات العقدة الجسدية الدهليزية والحلزونية المعزولة في المختبر لفهم كيفية مساهمة القنوات الأيونية ومستقبلات الناقل العصبي في استجابة هذه الخلايا العصبية. يسمح التشكل المضغوط لأجسام الخلايا المعزولة بتسجيلات كهربائية عالية الجودة ، ومناسبة للتوصيف التفصيلي للقنوات الأيونية ذات الجهد الكهربائي ومستقبلات الناقل العصبي. يسمح الوصول السهل إلى مجموعة متنوعة تمثيلية من الأنواع الفرعية للخلايا العصبية بإجراء تحليل عالي الإنتاجية لتنوع الخلايا.
تقدم هذه المقالة طريقة لعزل وزراعة أجسام الخلايا العقدية المنفصلة عن الجزء العلوي من العقدة الدهليزية في الفئران في يوم ما بعد الولادة (P) 9 إلى P20. كما يتم تقديم اقتراحات لتوسيع هذه الطرق لتشمل العقدة الحلزونية ، بالإضافة إلى الخطوات المطلوبة لاستخراج الخلايا العقدية وفصلها وطلائها بنجاح. هذه الأساليب هي تطور لتلك التي تم ابتكارها في المنشورات من مختلف المختبرات8،9،10. تتضمن هذه الورقة أيضا إرشادات لاختيار الخلايا السليمة لتسجيلات المشبك الرقعي.
أخيرا ، يحدد البروتوكول إجراء تسجيل مشبك التصحيح باستخدام تكوين التصحيحالمثقب 11. على الرغم من أن تكوين التصحيح المثقوب يستغرق وقتا أطول وأكثر تحديا من الناحية الفنية من تكوين التصحيح الممزق الأكثر شيوعا ، إلا أنه أفضل للحفاظ على بيئة السيتوبلازم التي تسمح بجلسات تسجيل طويلة ومستقرة. تتضح فوائد تكوين التسجيل هذا هنا من خلال تحسين استقرار التيارات الكاتيونية المنشطة بفرط الاستقطاب في الرقعة المثقبة بالنسبة إلى تسجيلات التصحيح الممزق.
تم تنظيم هذا البروتوكول في خمسة أقسام. تصف الأقسام 1-3 الحلول والأدوات التي يمكن إعدادها وتخزينها مسبقا. يصف القسم 4 خطوات تشريح وطلاء الدهليزي و SGNs. يصف القسم 5 خطوات التسجيل من الخلايا العصبية بعد فترة في الثقافة. في أيدينا ، يتم تنفيذ القسم 4 والقسم 5 على مدى 2 أيام متتالية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطرق المعروضة هنا خاصة بالتسجيلات من الخلايا العصبية المعزولة. ركزت الدراسات السابقة على التسجيلات من المحطات المحورية في إعداد شبه سليم. عند مقارنتها بتقنيات التسجيل الطرفية الحالية ، توفر التسجيلات المعزولة سلوكا فائقا لمشبك الفضاء وجهدا متساويا. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر هذا البروتوك…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نقدر الدكتور جينغ بينغ شيويه وروث آن إيتوك لمساهماتهما المبكرة في هذه الأساليب. تم دعم هذا العمل من قبل NIH NIDCD R03 DC012652 و NIH NIDCD DC012653S ، و R01 DC0155512 إلى RK و T32 DC009975 إلى DB و NN و KR.
Materials
| Amphotericin | Sigma-Aldrich | A4888-100MG | For perforated patch recordings. |
| ATP di-sodium | Sigma-Aldrich | A7699 | Additive to internal solution |
| B27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | additive to culture medium, for SGN |
| Beakers (1000, 100, 10) milliliter | |||
| bench-top centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | |
| Bunsen burner | |||
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | Additive to internal solution |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C5318 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22×40 | Warner Instruments | 64-0707 | |
| DMSO | Biotium | 90082 | |
| Dnase I,from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 11284932001 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Dumont #3 Forceps (Blunt) | Fine Science Tools | 11231-30 | |
| Dumont #5 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont #55 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E0396 | Additive to internal solution |
| Electrode Puller | Narashige | PC-10 | |
| Epi-illumination light source | Zeiss | CL 1500 ECO | |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | for cleaning head and around dissection bench |
| Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes | Sutter Instruments | BF140-117-10 | |
| Fine-edged dissection blade | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Glass Pasteur Pipettes | VWR | 14673-010 | to pull trituration pipettes |
| Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | additive to culture medium |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | for pH buffering all solutions in protocol |
| Hot plate / magnetic stirrers | VWR | 76549-914 | |
| Insulated bucket filled with ice | to keep all samples and solutions cool | ||
| K2SO4, Potassium Sulfate | Sigma Aldrich | P9458-250G | Additive to internal solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | P93333 | Additive to internal solution |
| KOH (1 M) | Honeywell | 319376-500ML | To bring internal solution to desired pH. |
| Large Spring Scissors | Fine Science Tools | 14133-13 | |
| Leibovitz medium | Sigma Aldrich | L4386 | dissection and bath solutions |
| Low-profile-bath recording chamber for culture dishes | Warner Instruments | 64-0236 | |
| luer-lok syringes, 30 ml | BD | 302832 | for drawing L-15/HEPES/HEPES solution. |
| MEM + Glutamax Supplement | Fisher Scientific | 41-090-101 | base of the culture medium |
| MgCl2-Hexahydrate | Sigma-Aldrich | M1028 | Additive to internal solution |
| microFil needle for filling micropipettes – 34 gauge | World Precision Instruments | MF34G | |
| Microforge | Narashige | MF-90 | For electrode polishing. |
| N2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | additiive to culture medium, for SGN |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Additive to internal solution |
| NaOH (1 M) | Thomas Scientific | 319511-500ML | for titration pH |
| Osmometer | Advanced Instruments Inc. | 3320 | |
| Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing | USC Material Management | MEDOX200 (Identifier: 00015) | for dissolving into dissection and bath solutions |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| Pasteur pipette bulb (3 ml) | Fisher Scientific | 03-448-25 | bulb for trituration pipettes |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | additive to prevent contamination of culture medium |
| Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg dosing) | MWI Animal Health | 15199 | for euthanasia |
| PES membrane filters , 0.2 micrometer | Nalgene | 566-0020 | for filtering solutions |
| PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm | CELLTREAT | 229747 | for filtering solutions drawn into syringes |
| Petri dishes, 35 x 10 mm | Genessee Scientific | 32-103 | for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration |
| Petri Dishes, 60 x 15 mm | Midland Scientific | P7455 | for gross dissection |
| pH Meter | Mettler Toledo | Model S20 | |
| Pipettors (1000, 200, 10) microliter | USA Scientific | ||
| Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish | Mattek | P35GC-0-10-C | to plate neurons for culture |
| Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes | Warner Instruments | 64-0375 | |
| Reference Cell | World Precision Instruments | RC1T | |
| Scalpel blade | Miltex | 4-315 | |
| Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scientific Scale | Mettler Toledo | XS64 | |
| Serological Pipettes (10, 25) milliliter | Fisher Scientific | ||
| Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber) | Warner Instruments | 64-0378 | |
| Small Animal Guillotine | Kent Scientific | DCAP | |
| Small animal guillotine | Kent Scientific | DCAP | for decapitation if dissecting rats older than P15. |
| Stereo Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Straight surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Syringe (3, 10, 30) milliliter | |||
| Trypsin | Sigma Aldrich | T1426 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Tuberculin syringe | Covidien | 8881500105 | for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection |
| Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Volumetric flask, 1000 milliliter | |||
| Vortex | VWR | 945300 | |
| Water, sterile u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system) | Millipore-Sigma | CDUFBI001 |
References
- Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
- Goldberg, J. M. Afferent diversity and the organization of central vestibular pathways. Experimental Brain Research. 130 (3), 277-297 (2000).
- Kalluri, R., Xue, J., Eatock, R. A. Ion channels set spike timing regularity of mammalian vestibular afferent neurons. Journal of Neurophysiology. 104 (4), 2034-2051 (2010).
- Smith, C. E., Goldberg, J. M. A stochastic afterhyperpolarizaton model of repetitive activity in vestibular afferents. Biological Cybernetics. 54 (1), 41-51 (1986).
- Berglund, A. M., Ryugo, D. K. Hair cell innervation by spiral ganglion neurons in the mouse. The Journal of Comparative Neurology. 255 (4), 560-570 (1987).
- Jagger, D. J., Housley, G. D. Membrane properties of type II spiral ganglion neurones identified in a neonatal rat cochlear slice. Journal of Physiology. 552, 525-533 (2003).
- Reid, M. A., Flores-Otero, J., Davis, R. L. Firing patterns of type II spiral ganglion neurons in vitro). The Journal of Neuroscience. 24 (3), 733-742 (2004).
- Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss. The Journal of Biological Chemistry. 285 (45), 34699-34707 (2010).
- Mo, Z. L., Davis, R. L. Endogenous firing patterns of murine spiral ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 77 (3), 1294-1305 (1997).
- Almanza, A., Luis, E., Mercado, F., Vega, R., Soto, E. Molecular identity, ontogeny, and cAMP modulation of the hyperpolarization-activated current in vestibular ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 108 (8), 2264-2275 (2012).
- Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. The Journal of General Physiology. 92 (2), 145-159 (1988).
- Grant, L., Yi, E., Goutman, J. D., Glowatzki, E. Postsynaptic recordings at afferent dendrites contacting cochlear inner hair cells: Monitoring multivesicular release at a ribbon synapse. Journal of Visualized Experiments. (48), e2442 (2010).
- Bronson, D., Kalluri, R. Muscarinic acetylcholine receptors modulate HCN channel properties in vestibular ganglion neurons. The Journal of Neuroscience. 43 (6), 902-917 (2023).
- Hodgkin, A. L., Huxley, A. F. The components of membrane conductance in the giant axon of Loligo. The Journal of Physiology. 116 (4), 473-496 (1952).
- Chabbert, C., Chambard, J. M., Valmier, J., Sans, A., Desmadryl, G. Voltage-activated sodium currents in acutely isolated mouse vestibular ganglion 17eurons. Neuroreport. 8 (5), 1253-1256 (1997).
- Bean, B. P. The action potential in mammalian central neurons. Nature Reviews. Neuroscience. 8 (6), 451-465 (2007).
- Izhikevich, E. M. . Dynamical Systems in Neuroscience. , (2018).
- Chabbert, C., Chambard, J. M., Sans, A., Desmadryl, G. Three types of depolarization-activated potassium currents in acutely isolated mouse vestibular neurons. Journal of Neurophysiology. 85 (3), 1017-1026 (2001).
- Risner, J. R., Holt, J. R. Heterogeneous potassium conductances contribute to the diverse firing properties of postnatal mouse vestibular ganglion neurons. Journal of Neurophysiology. 96 (5), 2364-2376 (2006).
- Iwasaki, S., Chihara, Y., Komuta, Y., Ito, K., Sahara, Y. Low-voltage-activated potassium channels underlie the regulation of intrinsic firing properties of rat vestibular ganglion cells. Journal of Neurophysiology. 100 (4), 2192-2204 (2008).
- Cervantes, B., Vega, R., Limón, A., Soto, E. Identity, expression and functional role of the sodium-activated potassium current in vestibular ganglion afferent neurons. Neuroscience. 240, 163-175 (2013).
- Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. Hyperpolarization-activated cation channels: From genes to function. Physiological Reviews. 89 (3), 847-885 (2009).
- Davis, R. L., Crozier, R. A. Dynamic firing properties of type I spiral ganglion neurons. Cell and Tissue Research. 361 (1), 115-127 (2015).
- Reijntjes, D. O. J., Pyott, S. J. The afferent signaling complex: Regulation of type I spiral ganglion neuron responses in the auditory periphery. Hearing Research. 336, 1-16 (2016).
- Eatock, R. A., Christov, F. . Ionic Conductances of Vestibular Afferent Neurons: Shaping Head Motion Signals From the Inner Ear. , (2020).
- Kalluri, R. Similarities in the biophysical properties of spiral-ganglion and vestibular-ganglion neurons in neonatal rats. Frontiers in Neuroscience. 15, 710275 (2021).
- Armstrong, C. E., Roberts, W. M. Electrical properties of frog saccular hair cells: distortion by enzymatic dissociation. The Journal of Neuroscience. 18 (8), 2962-2973 (1998).
- Rocha-Sanchez, S. M. S., et al. Developmental expression of Kcnq4 in vestibular neurons and neurosensory epithelia. Brain Research. 1139, 117-125 (2007).
- Meredith, F. L., Rennie, K. J. Zonal variations in K+ currents in vestibular crista calyx terminals. Journal of Neurophysiology. 113 (1), 264-276 (2015).
- Cai, H. Q., et al. Time-dependent activity of primary auditory neurons in the presence of neurotrophins and antibiotics. Hearing Research. 350, 122-132 (2017).
- Needham, K., Nayagam, B. A., Minter, R. L., O’Leary, S. J. Combined application of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 and its impact on spiral ganglion neuron firing properties and hyperpolarization-activated currents. Hearing Research. 291 (1-2), 1-14 (2012).
- Adamson, C. L., Reid, M. A., Davis, R. L. Opposite actions of brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 on firing features and ion channel composition of murine spiral ganglion neurons. The Journal of Neuroscience. 22 (4), 1385-1396 (2002).
- Zhou, Z., Liu, Q., Davis, R. L. Complex regulation of spiral ganglion neuron firing patterns by neurotrophin-3. The Journal of Neuroscience. 25 (33), 7558-7566 (2005).
- Liu, X. -. P., et al. Sodium channel diversity in the vestibular ganglion: NaV1.5, NaV1.8, and tetrodotoxin-sensitive currents. Journal of Neurophysiology. 115 (5), 2536-2555 (2016).
