Isolamento e Cultivo de Somatas Vestibulares e Gangliões Espirais de Roedores Neonatais para Gravações de Patch-Clamp
Summary
São apresentados métodos que fornecem instruções detalhadas para dissecar, dissociar, cultivar e registrar patch-clamp dos neurônios do gânglio vestibular e do gânglio espiral da orelha interna.
Abstract
A morfologia compacta dos neurônios ganglionares isolados e cultivados da orelha interna permite caracterizações detalhadas dos canais iônicos e receptores de neurotransmissores que contribuem para a diversidade celular nesta população. Este protocolo descreve os passos necessários para o sucesso da dissecação, dissociação e cultura em curto prazo da somata de neurônios bipolares da orelha interna para fins de gravações de patch-clamp. Instruções detalhadas para a preparação dos neurônios do gânglio vestibular são fornecidas com as modificações necessárias para o plaqueamento dos neurônios do gânglio espiral. O protocolo inclui instruções para a realização de gravações de patch-clamp de células inteiras na configuração de patch perfurado. Resultados de exemplo que caracterizam os registros de clamp de tensão de correntes mediadas por nucleotídeo cíclico ativado por hiperpolarização (HCN) destacam a estabilidade da configuração de gravação de patch perfurado em comparação com a configuração mais padrão de patch rompido. A combinação desses métodos, somata isolada mais registros perfurados de patch-clamp, pode ser usada para estudar processos celulares que requerem registros longos e estáveis e a preservação do meio intracelular, como a sinalização através de receptores acoplados à proteína G.
Introduction
Os neurônios bipolares do nervo vestibulococlear conectam as células ciliadas sensoriais da orelha interna ao tronco encefálico. São os principais portadores de informações sobre sons e movimentos da cabeça; Danos a essas células importantes levam à surdez e distúrbios do equilíbrio. As porções vestibular e auditiva do nervo são compostas, cada uma, por tipos celulares distintos e morfologicamentediversos1,2. No sistema vestibular, duas subpopulações aferentes disparam espontaneamente em intervalos regulares ouirregulares2. Acredita-se que o tempo da espícula aferente reflita uma diversidade subjacente na composição dos canaisiônicos 3,4. No sistema auditivo, existem duas subpopulações principais de neurônios do gânglio espiral (GNG); enquanto os GNC Tipo I entram em contato com células ciliadas internas individuais5, os GNs Tipo II entram em contato com múltiplas células ciliadas externas5. Registros in vitro de culturas semi-intactas e organotípicas sugerem diferenças nas propriedades de membrana dos SGNs Tipo I e TipoII 6,7.
Muitos canais iônicos e receptores de neurotransmissores encontrados nos terminais desses neurônios também são encontrados em seus corpos celulares. Dessa forma, culturas do somato vestibular isolado e do gânglio espiral podem ser estudadas in vitro para entender como canais iônicos e receptores de neurotransmissores contribuem para a resposta desses neurônios. A morfologia compacta dos corpos celulares isolados permite registros elétricos de alta qualidade, adequados para a caracterização detalhada de canais iônicos dependentes de voltagem e receptores de neurotransmissores. O fácil acesso a uma variedade representativa de subtipos de neurônios permite a análise de alto rendimento da diversidade celular.
Este artigo apresenta um método para isolar e cultivar corpos de células ganglionares dissociadas da porção superior do gânglio vestibular em ratos no dia pós-natal (P)9 a P20. Também são apresentadas sugestões para estender esses métodos ao gânglio espiral, além das etapas necessárias para extrair, dissociar e plaquear com sucesso as células ganglionares. Esses métodos são uma evolução daqueles desenvolvidos em publicações de diversos laboratórios8,9,10. Também está incluída neste artigo a orientação para a seleção de células saudáveis para gravações de patch-clamp.
Finalmente, o protocolo descreve o procedimento para o registro de patch-clamp usando a configuração de patch perfurado11. Embora a configuração de patch perfurado seja mais demorada e tecnicamente mais desafiadora do que a configuração de patch rompido mais comum, ela é melhor para manter o meio citoplasmático que permite sessões de gravação longas e estáveis. Os benefícios dessa configuração de gravação são ilustrados aqui através da estabilidade melhorada das correntes catiônicas ativadas por hiperpolarização em remendo-perfurado em relação aos registros de mancha-rompida.
Este protocolo está organizado em cinco seções. As seções 1 a 3 descrevem soluções e ferramentas que podem ser preparadas e armazenadas com antecedência. A seção 4 descreve os passos para dissecar e plaquear os vestibulares e SGNs. A seção 5 descreve os passos para o registro dos neurônios após um período em cultura. Em nossas mãos, a seção 4 e a seção 5 são realizadas durante um período de 2 dias consecutivos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os métodos aqui apresentados são específicos para registros de neurônios isolados; Estudos anteriores se concentraram em gravações de terminais de axônio em uma preparação semi-intacta. Quando comparados com as técnicas de gravação de terminais existentes, os registros isolados oferecem um comportamento de pinça espacial e isopotencial superior. Além disso, esse protocolo fornece acesso a uma amostra mais ampla de neurônios, uma vez que apenas subpopulações portadoras de cálice são acessíveis em regis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos aos Drs. Jing Bing Xue e Ruth Anne Eatock por suas primeiras contribuições a esses métodos. Este trabalho foi apoiado pelo NIH NIDCD R03 DC012652 e NIH NIDCD DC012653S, e R01 DC0155512 para RK e T32 DC009975 para DB, NN e KR.
Materials
| Amphotericin | Sigma-Aldrich | A4888-100MG | For perforated patch recordings. |
| ATP di-sodium | Sigma-Aldrich | A7699 | Additive to internal solution |
| B27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | additive to culture medium, for SGN |
| Beakers (1000, 100, 10) milliliter | |||
| bench-top centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | |
| Bunsen burner | |||
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | Additive to internal solution |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C5318 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Coverglass, rectangular, #1 thickness, 22×40 | Warner Instruments | 64-0707 | |
| DMSO | Biotium | 90082 | |
| Dnase I,from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | 11284932001 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Dumont #3 Forceps (Blunt) | Fine Science Tools | 11231-30 | |
| Dumont #5 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Dumont #55 Forceps (Fine) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E0396 | Additive to internal solution |
| Electrode Puller | Narashige | PC-10 | |
| Epi-illumination light source | Zeiss | CL 1500 ECO | |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | for cleaning head and around dissection bench |
| Filamented Borosilicate Capillaries for electrodes | Sutter Instruments | BF140-117-10 | |
| Fine-edged dissection blade | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Glass Pasteur Pipettes | VWR | 14673-010 | to pull trituration pipettes |
| Heat-inactivated Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16140063 | additive to culture medium |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-100G | for pH buffering all solutions in protocol |
| Hot plate / magnetic stirrers | VWR | 76549-914 | |
| Insulated bucket filled with ice | to keep all samples and solutions cool | ||
| K2SO4, Potassium Sulfate | Sigma Aldrich | P9458-250G | Additive to internal solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | P93333 | Additive to internal solution |
| KOH (1 M) | Honeywell | 319376-500ML | To bring internal solution to desired pH. |
| Large Spring Scissors | Fine Science Tools | 14133-13 | |
| Leibovitz medium | Sigma Aldrich | L4386 | dissection and bath solutions |
| Low-profile-bath recording chamber for culture dishes | Warner Instruments | 64-0236 | |
| luer-lok syringes, 30 ml | BD | 302832 | for drawing L-15/HEPES/HEPES solution. |
| MEM + Glutamax Supplement | Fisher Scientific | 41-090-101 | base of the culture medium |
| MgCl2-Hexahydrate | Sigma-Aldrich | M1028 | Additive to internal solution |
| microFil needle for filling micropipettes – 34 gauge | World Precision Instruments | MF34G | |
| Microforge | Narashige | MF-90 | For electrode polishing. |
| N2 Supplement (100x) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | additiive to culture medium, for SGN |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | Additive to internal solution |
| NaOH (1 M) | Thomas Scientific | 319511-500ML | for titration pH |
| Osmometer | Advanced Instruments Inc. | 3320 | |
| Oxygen, Medical grade, with adequate regulator and tubing | USC Material Management | MEDOX200 (Identifier: 00015) | for dissolving into dissection and bath solutions |
| Parafilm | Bemis | PM992 | |
| Pasteur pipette bulb (3 ml) | Fisher Scientific | 03-448-25 | bulb for trituration pipettes |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | additive to prevent contamination of culture medium |
| Pentobarbital based euthanasia solution (e.g., Fatal Plus. 50 – 60 mg/kg dosing) | MWI Animal Health | 15199 | for euthanasia |
| PES membrane filters , 0.2 micrometer | Nalgene | 566-0020 | for filtering solutions |
| PES membrane sterile syringe filters, 0.22 um, 30 mm | CELLTREAT | 229747 | for filtering solutions drawn into syringes |
| Petri dishes, 35 x 10 mm | Genessee Scientific | 32-103 | for micro dissection and to hold Tip dip solution in perforated-patch configuration |
| Petri Dishes, 60 x 15 mm | Midland Scientific | P7455 | for gross dissection |
| pH Meter | Mettler Toledo | Model S20 | |
| Pipettors (1000, 200, 10) microliter | USA Scientific | ||
| Poly-d-lysine coated glass bottomed culture dish | Mattek | P35GC-0-10-C | to plate neurons for culture |
| Quick change platform, heated base, for 35 mm culture dishes | Warner Instruments | 64-0375 | |
| Reference Cell | World Precision Instruments | RC1T | |
| Scalpel blade | Miltex | 4-315 | |
| Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scientific Scale | Mettler Toledo | XS64 | |
| Serological Pipettes (10, 25) milliliter | Fisher Scientific | ||
| Silicone Grease Kit (for sealing coverglass and chamber) | Warner Instruments | 64-0378 | |
| Small Animal Guillotine | Kent Scientific | DCAP | |
| Small animal guillotine | Kent Scientific | DCAP | for decapitation if dissecting rats older than P15. |
| Stereo Dissection Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Straight surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Syringe (3, 10, 30) milliliter | |||
| Trypsin | Sigma Aldrich | T1426 | one out of three enzyme to digest tissue |
| Tuberculin syringe | Covidien | 8881500105 | for delivering euthanasia solution by intraperitoneal injection |
| Vannas Spring Scissor, 2.5 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Volumetric flask, 1000 milliliter | |||
| Vortex | VWR | 945300 | |
| Water, sterile u ltrapure, R>18.18 megaOhms cm (e.g., filtered by a Millipore-Sigma water purification system) | Millipore-Sigma | CDUFBI001 |
References
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