Analisando a Morfologia Mitocondrial Através da Aprendizagem Supervisionada por Simulação

NOTA: As secções 1-4 podem ser omitidas se trabalharmos com imagens microscópicas existentes de mitocôndrias com condições experimentais conhecidas. 1. Cultura celular Cultivar as células H9c2 em DMEM sem glicose suplementada com 2 mM L-glutamina, 1 mM de piruvato de sódio, 10 mM de galactose, 10% de FBS, 1% de estreptomicina/penicilina e 1 μg/mL de puromicina. Permitir que as células se adaptem à galactose por pelo menos 7 dias em cultura antes dos experimentos.NOTA: As células H9c2 usadas aqui foram geneticamente modificadas para expressar mitocôndrias fluorescentes e também adquiriram um gene de resistência à puromicina. A adição deste antibiótico garante o crescimento de células com o gene de resistência e, portanto, mitocôndrias fluorescentes. Semear as células H9c2 para o experimento quando a confluência celular atingir aproximadamente 80% (frasco de cultura T75, avaliado por microscopia de campo brilhante). Pré-aqueça o meio e a tripsina a 37°C durante, pelo menos, 15 minutos antes de prosseguir.NOTA: É possível realizar o experimento em paralelo com duas ou mais condições diferentes de cultura celular. A confluência celular H9c2 não deve estar acima de 80% para evitar a perda de células mioblásticas. Com 100% de confluência, as células formam miotubos e começam a se diferenciar. Prepare-se para semear as células, operando em um exaustor de fluxo laminar estéril, colocando uma tampa de vidro #1.5 para cada condição experimental em um poço de uma placa de 12 poços. Rotule cada condição e os detalhes experimentais na placa de 12 poços. Mover o balão de cultura celular da incubadora para a superfície de trabalho no exaustor. Aspirar o meio usando um sistema de aspiração ou pipeta eletrônica e, em seguida, lavar duas vezes com 5 mL de PBS (temperatura ambiente). Mova a tripsina pré-aquecida para a superfície de trabalho e aspirar a lavagem final do PBS; em seguida, adicionar a tripsina pré-aquecida para descolar as células (1 ml para um balão de cultura T75). Colocar o balão de cultura de volta na incubadora durante 2-3 min a 37°C. Mova o meio pré-aquecido para a superfície de trabalho no final da incubação. Verifique se as células se desprenderam usando um microscópio de campo brilhante.Se todas as células não tiverem se desprendido, aplique várias torneiras cuidadosas, mas firmes, ao lado do balão para separar as células restantes. Devolva o frasco de cultura à superfície de trabalho. Adicionar 4 ml de meio de cultura celular ao balão de cultura utilizando uma pipeta electrónica para parar a acção da tripsina. Ao adicionar o meio de cultura ao balão, utilizar a pipeta para dispersar repetidamente o meio pela superfície para se desprender e reunir as células numa suspensão celular. Pipetar a suspensão celular (5 ml) do balão para um tubo de 15 ml. Centrifugar as células a 200 x g durante 5 min. Abra o tubo no exaustor, remova o sobrenadante por aspiração e ressuspenda a pastilha celular suavemente em 5 mL de meio de cultura celular. Avalie o número de células analisando um pequeno volume da suspensão celular em um contador de células automatizado. Observe o número de células vivas por mililitro de meio de cultura. Mova o volume desejado (por exemplo, 150 μL por poço) da suspensão celular, calculado para uma densidade de semeadura de aproximadamente 2 x 104 células/cm2, para um tubo de centrífuga pré-marcado de 15 mL. Adicionar o meio de cultura celular pré-aquecido ao tubo de centrífuga de 15 mL a um volume pré-calculado com base no número de poços. Para placas de 12 poços, use um volume total de 1 mL para cada poço. Certifique-se de que a suspensão de células diluídas está devidamente misturada, pipetando o conteúdo do tubo de centrífuga para cima e para baixo várias vezes antes de dispensar o volume apropriado para cada poço. Uma vez que a suspensão celular é dispensada no poço, agite a placa de maneira cuidadosamente controlada em cada direção para melhor distribuir as células por todos os poços. Coloque a placa de 12 poços na incubadora a 37°C até o dia seguinte. Verifique as células com um microscópio de campo brilhante para avaliar o crescimento. Se as células tiverem atingido um crescimento suficiente para aproximadamente 80% de confluência, prossiga para os próximos passos; caso contrário, repita a avaliação diariamente até que o crescimento suficiente seja alcançado. 2. Procedimento experimental Calcular as quantidades necessárias dos materiais para a experiência de acordo com as concentrações de solução-mãe. Descongelar os materiais congelados (solução-mãe de CCCP a 30 mM) a 37 °C e ajustar o meio de cultura celular para pré-aquecer a 37 °C. Uma vez descongelada, criar uma solução de trabalho de 10 μM CCCP diluindo a solução-mãe (1:3.000) em meio de cultura celular.NOTA: Não pipetar volumes inferiores a 1 μL. Inicie os tratamentos experimentais uma vez que todos os materiais necessários estejam preparados e pré-aquecidos. Aspirar o meio de cultura celular dos poços da placa de 12 poços e, em seguida, aplicar rapidamente o meio pré-aquecido fresco nos poços de controle e o meio pré-aquecido com solução CCCP de 10 μM nos poços de condição de teste. Incubar a placa de 12 poços na incubadora de células a 37°C por 2 h. Durante o período de incubação, prepare a solução de fixação. Para a preparação da solução de fixação, use paraformaldeído a 4% (PFA) pré-fabricado para diluir a solução de estoque de glutaraldeído (GA) a 25% a 0,2% (1:125). Ajuste a solução para pré-aquecer a 37°C. Para uma placa de 12 poços, 500 μL é suficiente por poço.CUIDADO: PFA e GA são produtos químicos tóxicos. Trabalhe em um exaustor químico com equipamento de proteção. Consulte seus respectivos SDS para obter detalhes. Quando o período de incubação estiver completo, remova a placa de 12 poços da incubadora e coloque-a na superfície de trabalho.NOTA: O trabalho não requer mais um ambiente estéril. Aspirar o meio de cultura celular dos poços e aplicar a solução de fixação pré-aquecida. Devolva a placa de 12 poços à incubadora a 37°C por 20 min. Aspirar a solução de fixação após completar a incubação e lavar cada poço duas vezes com PBS à temperatura ambiente. É possível pausar o experimento nesta fase do protocolo e continuar mais tarde.Se o experimento for pausado, adicione 1 mL de PBS por poço, sele a placa de 12 poços com filme plástico (parafilme) e armazene a 4°C. 3. Coloração e montagem das células nas folhas de cobertura Descongele o estoque de DAPI (mancha nuclear) e gire para baixo em uma minicentrífuga antes de abrir. Preparar a solução de coloração DAPI diluindo o estoque de DAPI em PBS (1:1.000). Aspirar o PBS da placa de 12 poços e aplicar 1 mL de solução de coloração DAPI em cada poço. Incubar no escuro à temperatura ambiente durante 5 min. Aspirar a solução de coloração DAPI. Lave duas vezes com 2 mL de PBS por poço. Prepare lâminas de microscópio de vidro fosco (lâminas de vidro) lavando-as em etanol a 70%, seguidas de três lavagens em PBS. Seque cuidadosamente as lâminas usando toalhas de papel sem fiapos e direcione-as para a luz para verificar se há sinais de poeira ou graxa.NOTA: Luvas são necessárias para esta etapa. Rotule as lâminas de vidro com os detalhes experimentais. Transfira o meio de montagem para um tubo de microcentrífuga e gire para baixo em uma minicentrífuga. Prepare-se para montar as tampas organizando o espaço de trabalho. Mantenha uma placa de 12 poços com folhas de cobertura, lâminas de vidro rotuladas, meio de montagem, uma pipeta, pontas de pipeta de 10 μL, toalhas de papel sem fiapos e pinças prontas. Aplique 10 μL de meio de montagem (ProLong Glass) a uma lâmina de vidro preparada para montar uma tampa. Pegue a folha de cobertura da placa de 12 poços usando uma pinça e tire a umidade da tampa tocando brevemente a borda e a parte de trás da folha de cobertura na toalha de papel sem fiapos preparada. Abaixe suavemente a tampa para baixo na gota do meio de montagem. Repita os dois passos acima para cada deslizamento de cobertura. Coloque as gotículas médias de montagem para permitir entre uma e quatro folhas de cobertura por lâmina de vidro. Certifique-se de que as lâminas de vidro estejam em uma superfície plana para evitar que as tampas montadas se movam. Coloque as lâminas de vidro em um local escuro à temperatura ambiente durante a noite para permitir que o meio de montagem se ajuste. As amostras agora estão prontas para geração de imagens. O experimento pode ser pausado nesta fase do protocolo e continuado posteriormente. Se o experimento for pausado nesta fase, depois de permitir que as amostras se fixem durante a noite à temperatura ambiente, cubra-as com papel alumínio para protegê-las da luz e armazene-as a 4 ° C. 4. Microscopia e imagem Cubra as amostras em papel alumínio para transporte (se ainda não estiver feito). Ao chegar à instalação de microscopia, use H2O duplamente destilado com papel de filtro de microscópio para limpar os resíduos de PBS das folhas de cobertura nas lâminas de vidro. Verifique se não há manchas nas tampas, segurando as lâminas de vidro em direção a uma luz brilhante. Passe pelo procedimento de inicialização do microscópio. Selecione a objetiva apropriada (Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil M27) e adicione o meio de imersão. Coloque a amostra no suporte da amostra. Dentro do software do microscópio, use a guia “Localizar” para ativar a iluminação de fluorescência EGFP e, usando os óculos, ajuste manualmente o nível z para ter a amostra em foco. Desligue a iluminação de fluorescência ao encontrar o foco. Alterne para a guia “Adquirir” dentro do software do microscópio. Use a “Configuração inteligente” para selecionar os canais de fluorescência a serem usados para geração de imagens. Para este experimento, foram selecionadas as predefinições de canais EGFP e DAPI. Ajuste a intensidade de cada canal a partir das configurações iniciais usando o histograma de intensidade como um guia para otimizar a intensidade do sinal. A geração de imagens pode começar agora. Para geração de imagens, use a opção do software para colocar as posições de imagem em uma matriz e centralize a matriz no meio da folha de cobertura com 12 posições totais a serem visualizadas. Verifique se cada posição na matriz contém células. Se não houver células, ajuste a posição para uma área com células. Ajuste o foco de cada posição na matriz usando o foco automático do software do microscópio e siga isso com um ajuste fino manual para garantir que o maior número possível de mitocôndrias esteja em foco.Observação : O canal EGFP é usado para esses ajustes manuais. Obtenha as imagens usando este método para cada folha de cobertura. Salve os arquivos de imagem e prossiga para as etapas para análise morfológica. 5. Gerando dados de treinamento simulados Baixe o código10 e descompacte o conteúdo. Siga as instruções em README.md para configurar o ambiente necessário. Navegue até a pasta chamada “src”, que é a pasta base deste projeto. As pastas numeradas dentro contêm códigos que são específicos para diferentes etapas de uso da ferramenta.Observação : use o comando “cd <>” para navegar para quaisquer subpastas do código. Para executar qualquer arquivo python, use o comando “python <>.py”. A apresentação chamada “Tutorial.pptx” contém um conjunto completo de instruções para usar o modelo de segmentação. Faça uma cópia ou use a pasta “2. Mitochondria Simulation Airy”, e renomeá-lo (Airy é usado aqui, pois é a função PSF mais próxima de um microscópio confocal, que foi usado como o microscópio atual). Vá para a pasta chamada “simulador”.Observação : esta pasta contém todos os arquivos relacionados à simulação dos dados de treinamento. Existem três conjuntos de parâmetros a serem definidos para a simulação. Primeiro, para o simulador no arquivo de configuração em lote “simulator/batch/bxx.csv”, defina os parâmetros para cerca da amostra, incluindo o número de mitocôndrias, a faixa de diâmetros e os comprimentos das estruturas, a faixa do eixo z que a estrutura exibe e a densidade dos fluoróforos. Em seguida, defina os parâmetros relacionados ao sistema óptico.Este conjunto inclui o tipo de microscópio (que determina qual modelo PSF é selecionado), a abertura numérica (N.A.), a ampliação (M), o tamanho do pixel (em μm), o comprimento de onda de emissão dos fluoróforos e o parâmetro de ruído de fundo, etc. Defina os parâmetros ópticos de N.A., a ampliação e o comprimento de onda mínimo do conjunto de dados no arquivo “simulator/microscPSFmod.py”. Defina o valor desejado para o tamanho do pixel e defina o comprimento de onda de emissão do conjunto de dados como parâmetro para a função “process_matrix_all_z” no arquivo “simulator/generate_batch_parallel.py”. Defina os três últimos parâmetros da função “save_physics_gt” no arquivo “simulator/generate_batch_parallel.py”. Os parâmetros são tamanho do pixel (no nm), tamanho da imagem de saída e max_xy. Defina o terceiro conjunto de parâmetros em relação ao conjunto de dados de saída, como o tamanho das imagens de saída, o número de blocos em cada imagem e o número total de imagens, no arquivo “simulator/generate_batch_parallel.py”. Execute o arquivo “simulator/generate_batch_parallel.py” para iniciar a simulação. Para obter a imagem de tamanho final, faça uma cópia da pasta chamada “5. Preparação de dados e treinamento/preparação de dados” na pasta inicial e navegue até ela.NOTA: Cada imagem do conjunto de dados sintético é formada pela criação de uma montagem de quatro imagens simuladas de 128 pixels x 128 pixels, o que dá um tamanho final de imagem de 256 pixels x 256 pixels. Isso primeiro gera muitos blocos individuais (cerca de 12.000) para as imagens do microscópio (na pasta “saída”) e segmentações de verdade do solo (na pasta “saída/physics_gt”).Defina os parâmetros do número do lote, o número de imagens por lote e o intervalo de ruído em “data_generator.py”. Execute o arquivo “data_generator.py” para criar as imagens de montagem. Copie as pastas chamadas “imagem” e “segmento” para o “5. Preparação de dados e treinamento/datatrain/train” pasta da pasta “5. Preparação e Treinamento de Dados/preparação de dados/dados”. 6. Segmentação baseada em aprendizagem profunda Treine o modelo de segmentação nas imagens simuladas da seguinte maneira:Para treinar o modelo de segmentação para um novo microscópio, navegue até o “5. Data Preparation and Training/train” e defina os parâmetros do tamanho do lote, o modelo de backbone para a segmentação, o número de épocas e a taxa de aprendizado para treinamento no arquivo “train_UNet.py”. Execute “train_UNet.py” para iniciar o treinamento. O processo de treinamento exibe a métrica para o desempenho da segmentação no conjunto de validação simulado.Observação : após a conclusão do treinamento, o modelo é salvo como “best_model.h5” no “5. Preparação de Dados e Treinamento/treinamento” folder. Teste o modelo em imagens de microscópio reais que são divididas para um tamanho desejável para o modelo treinado através das etapas a seguir.Navegue até “6. Prepare Test Data” e copie o “. png” formatar arquivos dos dados para a pasta “png”. Execute o arquivo “split_1024_256.py” para dividir as imagens em um tamanho desejável para o modelo treinado. Isso cria cortes de tamanho de 256 pixels x 256 pixels das imagens na pasta “dados”. Copie a pasta “dados” criada para o “7. Segmentação de teste” pasta. Navegue até a pasta “7. Test Segmentation” e defina o nome do modelo salvo a ser usado. Para segmentar as culturas, execute o arquivo “segment.py”. As imagens segmentadas são salvas na pasta “saída”. 7. Análise morfológica: Análise da morfologia mitocondrial dos dois grupos de dados, “Glicose” e “CCCP” Organize os dados a serem analisados (uma pasta para cada imagem, com cada pasta contendo as culturas de saída segmentadas de uma imagem). Baixe e coloque o arquivo suplementar chamado “make_montage.py” na pasta chamada “7. Segmentação de Testes”. Execute o arquivo “make_montage.py” para costurar a saída segmentada de volta ao tamanho original da imagem. Crie uma nova pasta chamada “9. Análise Morfológica ” dentro da pasta “src “. Instale os pacotes Skan16 e Seaborn Python no ambiente usando o comando “pip install seaborn[stats] skan”.NOTA: As máscaras de segmentação são esqueletizadas usando a biblioteca chamada Skan para permitir a análise da topologia de cada mitocôndria individual. Coloque o arquivo suplementar ” analyze_mitochondria.py ” na pasta “9. Análise Morfológica”. Organize as imagens de diferentes grupos do experimento em diferentes pastas dentro da pasta “7. Segmentação de Testes”. Defina os parâmetros de “tamanho do pixel” e “caminho de entrada” no arquivo “analyze_mitochondria.py”. Execute o arquivo ” analyze_mitochondria.py” para executar o código para esqueletizar e criar gráficos da análise.