シミュレーション教師あり学習によるミトコンドリア形態の解析

注:セクション1〜4は、既知の実験条件でミトコンドリアの既存の顕微鏡画像を使用する場合は省略できます。 1. 細胞培養 2 mM L-グルタミン、1 mMピルビン酸ナトリウム、10 mMガラクトース、10S、1%ストレプトマイシン/ペニシリン、および1 μg/mLピューロマイシンを添加したグルコースなしでDMEMでH9c2細胞を増殖させます。実験の前に、細胞を培養で少なくとも7日間ガラクトースに適応させます。注:ここで使用されるH9c2細胞は、蛍光ミトコンドリアを発現するように遺伝子改変されており、ピューロマイシン耐性遺伝子も獲得しています。この抗生物質の添加は、耐性遺伝子、したがって蛍光性ミトコンドリアを有する細胞の増殖を確実にする。 細胞コンフルエントが約80%に達したら、実験のためにH9c2細胞を播種する(T75培養フラスコ、明視野顕微鏡で評価)。先に進む前に、培地とトリプシンを37°Cに少なくとも15分間予熱します。注:2つ以上の異なる細胞培養条件で並行して実験を実行することが可能です。筋芽細胞の損失を防ぐために、H9c2細胞のコンフルエントは80%を超えてはなりません。100%コンフルエントで、細胞は筋管を形成し、分化し始めます。 12ウェルプレートのウェルに各実験条件の#1.5ガラスカバーガラスを置くことにより、滅菌層流フードで操作して細胞を播種する準備をします。各条件と実験の詳細を12ウェルプレートにラベル付けします。 細胞培養フラスコをインキュベーターからフード内の作業面に移動します。吸引システムまたは電動ピペットを使用して培地を吸引し、5 mLのPBS(室温)で2回洗浄します。 予熱したトリプシンを作業面に移動し、最後のPBS洗浄を吸引します。次に、予熱したトリプシンを加えて細胞を剥離します(T75培養フラスコの場合は1 mL)。培養フラスコをインキュベーターに戻し、37°Cで2〜3分間待ちます。 予熱した培地をインキュベーションの終わりに向かって作業面に移動します。明視野顕微鏡を使用して細胞が剥離したことを確認します。すべての細胞が剥離していない場合は、フラスコの側面に数回注意深くしっかりとタップして、残りの細胞を剥離します。 培養フラスコを作業面に戻します。電動ピペットを使用して培養フラスコに4 mLの細胞培養液を加え、トリプシン作用を停止します。フラスコに培地を添加する場合は、ピペットを使用して培地を表面全体に繰り返し分散させ、細胞を剥離して細胞懸濁液に集めます。 細胞懸濁液(5 mL)をフラスコから15 mLチューブにピペットで入れます。 細胞を200 x g で5分間遠心分離します。フード内のチューブを開き、吸引によって上清を取り除き、細胞ペレットを5 mLの細胞培養培地に穏やかに再懸濁します。 自動セルカウンターで少量の細胞懸濁液を分析することにより、細胞数を評価します。培地1ミリリットル当たりの生細胞数に注目してください。 約2 x 104 細胞/cm2の播種密度で計算された細胞懸濁液の所望の容量(例えば、ウェルあたり150 μL)を、事前に標識された15 mL遠沈管に移します。予熱した細胞培養培地を、ウェル数に基づいて事前に計算された容量で15 mL遠沈管に追加します。12ウェルプレートの場合、各ウェルに1 mLの総容量を使用します。 各ウェルに適切な容量を分注する前に、遠沈管の内容物を数回上下にピペッティングして、希釈した細胞懸濁液が適切に混合されていることを確認します。細胞懸濁液がウェルに分注されたら、各方向に注意深く制御された方法でプレートを振って、ウェル全体に細胞をより適切に分散させます。12ウェルプレートを翌日まで37°Cのインキュベーターに入れます。 明視野顕微鏡で細胞をチェックして、増殖を評価します。細胞が約80%のコンフルエントまで十分な成長を達成した場合は、次のステップに進みます。それ以外の場合は、十分な成長に達するまで毎日評価を繰り返します。 2. 実験手順 原液濃度に応じて、実験に必要な材料の量を計算します。凍結した材料(30 mM CCCPストック溶液)を37°Cで解凍し、細胞培養培地を37°Cで予熱するように設定した。 解凍したら、ストック溶液(1:3,000)を細胞培養培地で希釈して、10 μM CCCPの作業溶液を作成します。注意: 1μL未満の容量をピペットで送らないでください。 必要な材料がすべて準備され、予熱されたら、実験的処理を開始します。12ウェルプレートのウェルから細胞培養培地を吸引し、新鮮な予熱培地をコントロールウェルにすばやく適用し、予熱した培地を10 μM CCCP溶液とともに試験条件ウェルにすばやく塗布します。 12ウェルプレートを37°Cのセルインキュベーターで2時間インキュベートします。潜伏期間中に、固定溶液を調製する。 固定液の調製には、あらかじめ用意されている4%パラホルムアルデヒド(PFA)を使用して、25%グルタルアルデヒド(GA)ストック溶液を0.2%(1:125)に希釈します。溶液を37°Cで予熱するように設定します。 12ウェルプレートの場合、ウェルあたり500 μLで十分です。注意: PFAとGAは有毒化学物質です。保護具付きの化学フードで作業してください。詳細については、それぞれのSDSを参照してください。 インキュベーション期間が完了したら、12ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、作業面に置きます。注:作業はもはや無菌環境を必要としません。 ウェルから細胞培養液を吸引し、予熱した固定液を塗布する。12ウェルプレートを37°Cのインキュベーターに20分間戻します。 インキュベーションが完了したら固定液を吸引し、室温PBSで各ウェルを2回洗浄します。プロトコルのこの段階で実験を一時停止し、後で続行することができます。実験を一時停止する場合は、ウェルあたり1 mLのPBSを追加し、12ウェルプレートをプラスチックフィルム(パラフィルム)で密封し、4°Cで保存します。 3.カバーガラスへの細胞の染色と取り付け DAPI(核染色)ストックを解凍し、開封前にミニ遠心分離機でスピンダウンします。DAPIストックをPBS(1:1,000)で希釈してDAPI染色液を調製します。 12ウェルプレートからPBSを吸引し、各ウェルに1 mLのDAPI染色溶液を塗布します。暗所で室温で5分間インキュベートします。 DAPI染色液を吸引します。ウェルあたり2 mLのPBSで2回洗浄します。 すりガラス顕微鏡スライド(スライドガラス)を70%エタノールで洗浄し、続いてPBSで3回洗浄して準備します。糸くずの出ないペーパータオルを使用してスライドを注意深く乾かし、ライトに向けてほこりやグリースの兆候を確認します。注意: この手順には手袋が必要です。 スライドガラスに実験の詳細をラベル付けします。封入剤をマイクロ遠心チューブに移し、ミニ遠心分離機でスピンダウンします。 ワークスペースを配置して、カバーガラスを取り付ける準備をします。カバーガラス、ラベル付きスライドガラス、封入剤、ピペット、10 μLピペットチップ、糸くずの出ないペーパータオル、ピンセットが入った12ウェルプレートを用意してください。 準備したスライドガラスに10 μLの封入剤(ProLongガラス)を塗布し、カバーガラスを取り付けます。 ピンセットを使用して12ウェルプレートからカバーガラスを手に取り、カバーガラスの端と背面に軽く触れて、準備した糸くずの出ないペーパータオルに軽く触れて、カバースリップから湿気を軽くたたきます。カバーガラスを封入剤の液滴の上にそっと下ろします。 カバーガラスごとに上記の2つの手順を繰り返します。スライドガラスごとに1〜4枚のカバーガラスができるように、封入剤の液滴を配置します。 取り付けられたカバーガラスが動かないように、スライドガラスが平らな面にあることを確認してください。スライドガラスを室温の暗い場所に一晩置き、封入剤を固めます。これで、サンプルをイメージングする準備が整いました。実験は、プロトコルのこの段階で一時停止し、後で続行できます。 この段階で実験を一時停止する場合は、室温で一晩サンプルを固めた後、光から保護するためにアルミホイルで覆い、4°Cで保存します。 4. 顕微鏡とイメージング 輸送のためにサンプルをアルミホイルで覆います(まだ行っていない場合)。 顕微鏡施設に到着したら、顕微鏡ろ紙で二重蒸留H2Oを使用して、スライドガラスのカバーガラスからPBS残留物をきれいにします。スライドガラスを明るい光に向けて保持して、カバーガラスに斑点がないことを確認します。 顕微鏡の起動手順を実行します。適切な対物レンズ(プランアポクロマート63倍/1.40オイルM27)を選択し、液浸媒体を追加します。 サンプルをサンプルホルダーに入れます。顕微鏡ソフトウェア内で、[位置特定]タブを使用してEGFP蛍光照明をアクティブにし、接眼レンズを使用してzレベルを手動で調整してサンプルに焦点を合わせます。焦点を見つけたら、蛍光照明をオフにします。 顕微鏡ソフトウェア内の「取得」タブに切り替えます。「スマートセットアップ」を使用して、イメージングに使用する蛍光チャンネルを選択します。この実験では、EGFPチャンネルとDAPIチャンネルのプリセットを選択しました。 信号強度を最適化するためのガイドとして強度ヒストグラムを使用して、初期設定から各チャンネル強度を調整します。これでイメージングを開始できます。 イメージングの場合は、ソフトウェアのオプションを使用してイメージング位置をアレイに配置し、アレイをカバースリップの中央に配置し、合計12の位置をイメージングします。配列内の各位置にセルが含まれていることを確認します。セルがない場合は、位置をセルのある領域に調整します。 顕微鏡ソフトウェアのオートフォーカスを使用してアレイ内の各位置の焦点を調整し、これに続いて手動で微調整して、できるだけ多くのミトコンドリアに焦点が合うようにします。注意: EGFPチャネルは、これらの手動調整に使用されます。 カバーガラスごとにこの方法を使用して画像を取得します。画像ファイルを保存し、形態素解析の手順に進みます。 5. シミュレーショントレーニングデータの生成 コード10 をダウンロードし、内容を解凍します。README.md の指示に従って、必要な環境をセットアップします。 このプロジェクトのホームフォルダである「src」という名前のフォルダに移動します。内部の番号付きフォルダーには、ツールを使用するさまざまな手順に固有のコードが含まれています。注 : コマンド “cd <>” を使用して、コードのサブフォルダに移動します。Python ファイルを実行するには、コマンド “python <>.py” を使用します。「チュートリアル.pptx」という名前のプレゼンテーションには、セグメンテーションモデルを使用するための完全な手順が含まれています。 コピーを作成するか、フォルダ「2.ミトコンドリアシミュレーション Airy」と改名した(現在の顕微鏡として使用されていた共焦点顕微鏡に最も近いPSF関数であるため、ここではAiryを使用する)。「シミュレータ」という名前のフォルダに移動します。注: このフォルダには、トレーニング データのシミュレーションに関連するすべてのファイルが含まれています。シミュレーションに設定するパラメータは 3 セットあります。 まず、バッチ設定ファイル「simulator/batch/bxx.csv」のシミュレータに対して、ミトコンドリアの数、構造の直径と長さの範囲、構造が示すz軸の範囲、蛍光色素の密度など、サンプルに関するパラメータを設定します。 次に、光学系に関連するパラメータを設定します。このセットには、顕微鏡の種類(選択するPSFモデルを決定する)、開口数(N.A)、倍率(M)、ピクセルサイズ(μm単位)、蛍光色素の発光波長、バックグラウンドノイズパラメータなどが含まれます。 N.A.の光学パラメータ、倍率、データセットの最小波長をファイル「シミュレータ/microscPSFmod.py」に設定します。 画素サイズに希望の値を設定し、データセットの発光波長をパラメータとしてファイル「simulator/generate_batch_parallel.py」の「process_matrix_all_z」関数に設定します。 関数 “save_physics_gt” の最後の 3 つのパラメータをファイル “simulator/generate_batch_parallel.py” に設定します。パラメーターは、ピクセル サイズ (nm)、出力画像のサイズ、およびmax_xyです。 出力データセットに関する 3 番目のパラメーター セット (出力画像のサイズ、各画像のタイル数、合計画像数など) をファイル “simulator/generate_batch_parallel.py” に設定します。 ファイル “simulator/generate_batch_parallel.py” を実行してシミュレーションを開始します。 最終サイズのイメージを取得するには、”5.データ準備とトレーニング/データ準備」をクリックし、そのフォルダに移動します。注:合成データセットの各画像は、128ピクセルx128ピクセルの4つのシミュレートされた画像のモンタージュを作成することによって形成され、最終的な画像サイズは256ピクセルx256ピクセルになります。これにより、最初に、顕微鏡画像(「出力」フォルダー内)とグラウンドトゥルースセグメンテーション(「出力/physics_gt」フォルダー内)の両方に対して、多数の個別のタイル(約12,000)が生成されます。バッチ番号、バッチあたりの画像数、ノイズの範囲のパラメータを「data_generator.py」に設定します。 ファイル “data_generator.py” を実行してモンタージュ画像を作成します。 “image” と “segment” という名前のフォルダを “5.データ準備とトレーニング/データトレーニング/トレーニング」フォルダから「5.データ準備とトレーニング/データ準備/データ」。 6.ディープラーニングベースのセグメンテーション 次のように、シミュレートされた画像でセグメンテーション モデルをトレーニングします。新しい顕微鏡のセグメンテーションモデルをトレーニングするには、「5.データ準備とトレーニング/トレーニング」フォルダに、バッチサイズ、セグメンテーションのバックボーンモデル、エポック数、学習用の学習率のパラメータをファイル「train_UNet.py」で設定します。 「train_UNet.py」を実行してトレーニングを開始します。トレーニングプロセスでは、シミュレートされた検証セットのセグメンテーションのパフォーマンスのメトリックが表示されます。注: トレーニングが完了すると、モデルは “best_model.h5” として “5.データの準備とトレーニング/トレーニング」フォルダー。 次の手順で、トレーニング済みのモデルに適したサイズに分割された実際の顕微鏡画像でモデルをテストします。「6.テストデータを準備します」とコピーし、”.png” 形式のデータを “png” フォルダーに格納します。 ファイル “split_1024_256.py” を実行して、トレーニング済みのモデルに適したサイズに画像を分割します。これにより、「data」フォルダー内の画像の256ピクセルx256ピクセルサイズのトリミングが作成されます。 作成した「データ」フォルダを「7.テストセグメンテーション」フォルダ。 フォルダ「7.テストセグメンテーション」をクリックし、使用する保存済みモデルの名前を設定します。 作物をセグメント化するには、ファイル “segment.py”を実行します。セグメント化された画像は「出力」フォルダに保存されます。 7.形態素解析:「グルコース」と「CCCP」の2つのデータグループのミトコンドリア形態の解析 分析するデータを配置します (画像ごとに 1 つのフォルダー、各フォルダーには 1 つの画像のセグメント化された出力切り抜きが含まれます)。 “make_montage.py” という名前の補足ファイルをダウンロードし、”7.テストセグメンテーション」。 ファイル “make_montage.py” を実行して、セグメント化された出力を画像の元のサイズに戻します。 “9.形態素解析」を “src” フォルダ内に保存します。 Skan16 と Seaborn Python パッケージを、”pip install seaborn[stats] skan” コマンドを使用して環境にインストールします。注:セグメンテーションマスクは、Skanという名前のライブラリを使用してスケルトン化され、個々のミトコンドリアのトポロジーの分析を可能にします。 補足ファイル ” analyze_mitochondria.py ” をフォルダー “9.形態素解析”. 実験のさまざまなグループの画像をフォルダー内のさまざまなフォルダーに配置します “7.テストセグメンテーション」。 ファイル「 analyze_mitochondria.py」に「ピクセルサイズ」と「入力パス」のパラメータを設定します。 ファイル 「analyze_mitochondria.py」 を実行してコードを実行し、解析のスケルトン化とプロットを作成します。