ניתוח מורפולוגיה מיטוכונדריאלית באמצעות סימולציה למידה מבוקרת

הערה: ניתן להשמיט את סעיפים 1-4 אם עובדים עם תמונות מיקרוסקופיה קיימות של מיטוכונדריה בתנאי ניסוי ידועים. 1. תרבית תאים לגדל את תאי H9c2 ב-DMEM ללא תוספת גלוקוז עם 2 mM L-גלוטמין, 1 mM נתרן פירובט, 10 mM גלקטוז, 10% FBS, 1% סטרפטומיצין/פניצילין, ו-1 מיקרוגרם/מ”ל פורומיצין. אפשרו לתאים להסתגל לגלקטוז במשך 7 ימים לפחות בתרבית לפני הניסויים.הערה: תאי H9c2 המשמשים כאן הונדסו גנטית כדי לבטא מיטוכונדריה פלואורסצנטית ורכשו גם גן עמידות לפורומיצין. תוספת של אנטיביוטיקה זו מבטיחה את הצמיחה של תאים עם גן ההתנגדות, ובכך, מיטוכונדריה פלואורסצנטית. זרעו את תאי H9c2 לניסוי כאשר מפגש התאים מגיע לכ-80% (בקבוקון תרבית T75, המוערך על ידי מיקרוסקופ ברייטפילד). מחממים מראש את המדיום וטריפסין ל-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפחות לפני שממשיכים.הערה: ניתן לבצע את הניסוי במקביל לשני תנאים שונים או יותר של תרביות תאים. מפגש תאי H9c2 לא צריך להיות מעל 80% כדי למנוע אובדן של תאים מיובלסטיים. במפגש של 100%, התאים יוצרים מיוטיובים ומתחילים להתמיין. היכונו לזריעת התאים, הפועלים במכסה מנוע זרימה למינרית סטרילית, על ידי הצבת כיסוי זכוכית #1.5 לכל תנאי ניסוי בבאר של צלחת 12 באר. תייג כל תנאי ואת פרטי הניסוי על צלחת 12 הבאר. הזיזו את בקבוק תרבית התאים מהאינקובטור אל משטח העבודה במכסה המנוע. שאפו את המדיום באמצעות מערכת שאיפה או פיפטה אלקטרונית, ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם 5 מ”ל של PBS (טמפרטורת החדר). להעביר את טריפסין מחומם מראש אל משטח העבודה, ולשאוף את שטיפת PBS הסופית; לאחר מכן, הוסף את הטריפסין שחומם מראש כדי לנתק את התאים (1 מ”ל עבור בקבוק תרבית T75). החזירו את בקבוק התרבית לחממה למשך 2-3 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הזיזו את המדיום שחומם מראש אל משטח העבודה לקראת סוף הדגירה. ודא שהתאים התנתקו באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר.אם כל התאים לא התנתקו, יש למרוח מספר ברזים זהירים אך יציבים על צד הבקבוקון כדי לנתק את התאים הנותרים. החזירו את בקבוק התרבית למשטח העבודה. הוסף 4 מ”ל של מדיום תרבית תאים לבקבוקון התרבית באמצעות פיפטה אלקטרונית כדי לעצור את פעולת הטריפסין. בעת הוספת מדיום תרבית לבקבוקון, השתמש בפיפטה כדי לפזר שוב ושוב את המדיום על פני השטח כדי לנתק ולאסוף את התאים לתוך תרחיף תאים. צמחו את מתלה התא (5 מ”ל) מהבקבוקון לצינור של 15 מ”ל. צנטריפוגה התאים ב 200 x גרם במשך 5 דקות. פתח את הצינור במכסה המנוע, הסר את הסופר-נטנט על ידי שאיפה, והשהה את גלולת התא בעדינות ב-5 מ”ל של מדיה של תרבית תאים. הערך את מספר התאים על-ידי ניתוח נפח קטן של תרחיף התאים במונה תאים אוטומטי. שים לב למספר התאים החיים למיליליטר של מדיה תרבית. העבר את הנפח הרצוי (לדוגמה, 150 μL לכל באר) של תרחיף התא, המחושב עבור צפיפות זריעה של כ 2 x 104 תאים / ס”מ2, לתוך צינור צנטריפוגה מסומן מראש 15 מ”ל. הוסף את מדיום תרבית התאים המחוממת מראש לצינור הצנטריפוגה של 15 מ”ל בנפח מחושב מראש בהתבסס על מספר הבארות. עבור לוחות של 12 בארות, השתמש בנפח כולל של 1 מ”ל עבור כל באר. ודא כי מתלה התא המדולל מעורבב כראוי על ידי צינורית התוכן של צינור הצנטריפוגה למעלה ולמטה מספר פעמים לפני חלוקת הנפח המתאים לכל באר. לאחר חלוקת תרחיף התאים בבאר, נערו את הצלחת בצורה מבוקרת בקפידה לכל כיוון כדי לפזר טוב יותר את התאים ברחבי הבארות. הכניסו את צלחת 12 הבארות לתוך האינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד למחרת. בדוק את התאים עם מיקרוסקופ שדה בהיר כדי להעריך את הצמיחה. אם התאים השיגו צמיחה מספקת לכ-80% מפגש, המשך לשלבים הבאים; אחרת, חזור על ההערכה מדי יום עד להגעה לצמיחה מספקת. 2. הליך ניסיוני חשב את הכמויות הדרושות של החומרים לניסוי על פי ריכוזי התמיסה במלאי. הפשירו את החומרים הקפואים (תמיסת מלאי CCCP של 30 mM) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, והגדירו את תרבית התאים לחום מקדים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר ההפשרה, צור פתרון עובד של 10 μM CCCP על ידי דילול תמיסת המלאי (1:3,000) במדיום תרבית תאים.הערה: אין לבצע פיפטה בנפחים הנמוכים מ- 1 μL. התחל את הטיפולים הניסיוניים לאחר שכל החומרים הדרושים מוכנים ומחוממים מראש. שאפו את מדיום תרבית התאים מהבארות של צלחת 12 הבארות, ולאחר מכן החילו במהירות את המדיום הטרי שחומם מראש על בארות הבקרה ואת המדיום המחומם מראש עם תמיסת CCCP של 10 μM על בארות מצב הבדיקה. דגירה של צלחת 12 בארות באינקובטור התאים של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. במהלך תקופת הדגירה, הכינו את פתרון הקיבוע. להכנת תמיסת הקיבוע, השתמש בתמיסת פרפורמלדהיד 4% (PFA) מוכנה מראש כדי לדלל תמיסת מלאי של 25% גלוטראלדהיד (GA) ל-0.2% (1:125). הגדר את התמיסה לחימום מקדים בטמפרטורה של 37°C. עבור צלחת 12 באר, 500 μL מספיק לכל באר.אזהרה: PFA ו-GA הם כימיקלים רעילים. עבוד במכסה מנוע כימי עם ציוד מגן. עיין ב- SDS המתאים שלהם לקבלת פרטים. כאשר תקופת הדגירה הושלמה, הסר את צלחת 12 באר מן החממה, ומניחים אותו על משטח העבודה.הערה: העבודה אינה דורשת עוד סביבה סטרילית. שאפו את מדיום תרבית התאים מהבארות, והחלו את פתרון הקיבוע המחומם מראש. החזירו את צלחת ה-12 לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. שאפו את תמיסת הקיבוע עם השלמת הדגירה, ושטפו כל באר פעמיים עם PBS בטמפרטורת החדר. ניתן להשהות את הניסוי בשלב זה של הפרוטוקול ולהמשיך בהמשך.אם הניסוי מושהה, הוסיפו 1 מ”ל של PBS לכל באר, אטמו את צלחת 12 הבאר עם סרט פלסטיק (פרפילם), ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. 3. צביעה והרכבה של התאים על הכיסויים הפשירו את מלאי ה-DAPI (כתם גרעיני), והסתחררו במיני צנטריפוגה לפני הפתיחה. הכן תמיסת צביעה של DAPI על-ידי דילול מלאי DAPI ב-PBS (1:1,000). שאפו את ה-PBS מצלחת 12 הבארות, ומרחו 1 מ”ל של תמיסת צביעת DAPI על כל באר. לדגור בחושך בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. שאפו את תמיסת הכתמים DAPI. יש לשטוף פעמיים עם 2 מ”ל PBS לכל באר. הכינו שקופיות מיקרוסקופ מזכוכית חלבית (שקופיות זכוכית) על ידי שטיפתן ב-70% אתנול, ולאחר מכן שלוש שטיפות ב-PBS. ייבשו בזהירות את המגלשות באמצעות מגבות נייר ללא מוך, וכוונו אותן לכיוון האור כדי לבדוק אם יש סימני אבק או שומן.הערה: כפפות נדרשות לשלב זה. תייג את שקופיות הזכוכית עם הפרטים הניסיוניים. מעבירים את מדיום ההרכבה לצינור מיקרוצנטריפוגה, ומסתובבים במיני צנטריפוגה. התכוננו להרכבת הכיסויים על ידי סידור סביבת העבודה. שמור על צלחת של 12 בארות עם כיסויים, מגלשות זכוכית מסומנות, מדיום הרכבה, פיפטה, קצוות פיפטה של 10 μL, מגבות נייר ללא מוך ופינצטה מוכנה. יש למרוח 10 μL של מדיום הרכבה (זכוכית ProLong) על מגלשת זכוכית מוכנה כדי להרכיב כיסוי. הרימו את הכיסוי מצלחת 12 הבארות באמצעות פינצטה, והורידו את הלחות מהכיסוי על ידי נגיעה קצרה בקצה ובגב של הכיסוי למגבת הנייר המוכנה ללא מוך. הורידו בעדינות את הכיסוי כלפי מטה אל טיפת מדיום ההרכבה. חזור על שני השלבים לעיל עבור כל כיסוי. מקם את הטיפות הבינוניות להרכבה כדי לאפשר בין כיסוי אחד לארבעה כיסויים לכל מגלשת זכוכית. ודא ששקופיות הזכוכית נמצאות על משטח שטוח כדי למנוע את תזוזת הכיסויים המותקן. הניחו את מגלשות הזכוכית במיקום חשוך בטמפרטורת החדר למשך הלילה כדי לאפשר לאמצעי ההרכבה לשקוע. הדגימות מוכנות כעת להדמיה. ניתן להשהות את הניסוי בשלב זה של הפרוטוקול ולהמשיך מאוחר יותר. אם הניסוי מושהה בשלב זה, לאחר שאפשרו לדגימות להתייצב במשך הלילה בטמפרטורת החדר, כסו אותן ברדיד אלומיניום כדי להגן עליהן מפני אור, ואחסנו אותן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. 4. מיקרוסקופיה והדמיה מכסים את הדגימות ברדיד אלומיניום להובלה (אם עדיין לא נעשה). עם ההגעה למתקן המיקרוסקופיה, השתמש בזיקוק כפול H2O עם נייר מסנן מיקרוסקופ כדי לנקות את שאריות ה- PBS מהכיסויים על שקופיות הזכוכית. בדוק שאין כתמים על הכיסויים על ידי החזקת הזכוכית מחליק לעבר אור בהיר. עברו את הליך ההפעלה של המיקרוסקופ. בחר את המטרה המתאימה (Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil M27), והוסף מדיום טבילה. מקם את הדגימה במחזיק המדגם. בתוך תוכנת המיקרוסקופ, השתמש בכרטיסייה “אתר” כדי להפעיל את תאורת הפלואורסצנציה של EGFP, ובאמצעות העיניים, כוונן ידנית את רמת z כדי שהדגימה תהיה ממוקדת. כבה את התאורה הפלואורסצנטית עם מציאת המיקוד. עבור לכרטיסייה “רכישה” בתוך תוכנת המיקרוסקופ. השתמש ב”הגדרה חכמה” כדי לבחור את ערוצי הפלואורסצנציה שישמשו להדמיה. עבור ניסוי זה, נבחרו ההגדרות הקבועות מראש של ערוץ EGFP ו- DAPI. התאם את עוצמת כל ערוץ מההגדרות הראשוניות באמצעות היסטוגרמה של העוצמה כקו מנחה לעוצמת אות ממוטבת. כעת ניתן להתחיל בהדמיה. לצורך הדמיה, השתמש באפשרות של התוכנה כדי למקם את מיקומי ההדמיה במערך, ולמרכז את המערך באמצע הכיסוי עם 12 מיקומים בסך הכל לצילום. ודא שכל מיקום במערך מכיל תאים. אם אין תאים, התאם את המיקום לאזור עם תאים. כוונן את המיקוד של כל מיקום במערך באמצעות המיקוד האוטומטי של תוכנת המיקרוסקופ, ועקוב אחר כך עם כוונון עדין ידני כדי להבטיח שכמה שיותר מיטוכונדריה יהיו בפוקוס.הערה: ערוץ EGFP משמש להתאמות ידניות אלה. השג את התמונות בשיטה זו עבור כל כריכה. שמור את קבצי התמונה והמשך לשלבים לניתוח מורפולוגי. 5. הפקת נתוני אימון מדומים הורד את הקוד10, ופתח את התוכן. בצע את ההוראות README.md כדי להגדיר את הסביבה הנדרשת. נווט אל התיקיה בשם “src”, שהיא תיקיית הבית עבור פרוייקט זה. התיקיות הממוספרות בפנים מכילות קודים ספציפיים לשלבים שונים של השימוש בכלי.הערה: השתמש בפקודה “cd <>” כדי לנווט לכל תיקיות המשנה של הקוד. כדי להפעיל כל קובץ python, השתמש בפקודה “python <>.py”. המצגת בשם “Tutorial.pptx” מכילה סט שלם של הוראות לשימוש במודל הסגמנטציה. צור עותק או השתמש בתיקייה “2. סימולציית מיטוכונדריה אוורירי”, ולשנות את שמה (איירי משמשת כאן מכיוון שהיא פונקציית PSF הקרובה ביותר למיקרוסקופ קונפוקלי, ששימש כמיקרוסקופ הנוכחי). היכנס לתיקייה בשם “סימולטור”.הערה: תיקייה זו מכילה את כל הקבצים הקשורים לסימולציה של נתוני האימון. ישנן שלוש קבוצות של פרמטרים שיש להגדיר עבור הסימולציה. ראשית, עבור הסימולטור בקובץ תצורת האצווה “סימולטור/אצווה/bxx.csv”, הגדר את הפרמטרים לגבי המדגם, כולל מספר המיטוכונדריה, טווח הקטרים ואורכי המבנים, טווח ציר ה-z שהמבנה מציג וצפיפות הפלואורופורים. לאחר מכן, הגדר את הפרמטרים הקשורים למערכת האופטית.קבוצה זו כוללת את סוג המיקרוסקופ (הקובע איזה מודל PSF נבחר), הצמצם המספרי (N.A.), ההגדלה (M), גודל הפיקסלים (ב- μm), אורך גל הפליטה של הפלואורופורים ופרמטר רעש הרקע וכו ‘. הגדר את הפרמטרים האופטיים של N.A., את ההגדלה ואת אורך הגל המינימלי של ערכת הנתונים בקובץ “סימולטור/microscPSFmod.py”. הגדר את הערך הרצוי לגודל הפיקסלים, והגדר את אורך גל הפליטה של ערכת הנתונים כפרמטר לפונקציה “process_matrix_all_z” בקובץ “סימולטור/generate_batch_parallel.py”. הגדר את שלושת הפרמטרים האחרונים של הפונקציה “save_physics_gt” בקובץ “סימולטור/generate_batch_parallel.py”. הפרמטרים הם גודל פיקסלים (בננומטר), גודל תמונת הפלט ו- max_xy. הגדר את קבוצת הפרמטרים השלישית לגבי ערכת נתוני הפלט, כגון גודל תמונות הפלט, מספר האריחים בכל תמונה ומספר התמונות הכולל, בקובץ “סימולטור/generate_batch_parallel.py”. הפעל את הקובץ “סימולטור/generate_batch_parallel.py” כדי להתחיל את הסימולציה. כדי להשיג את התמונה בגודל הסופי, צור עותק של התיקיה בשם “5. הכנת נתונים והדרכה/הכנת נתונים” בתיקיית הבית, ונווט לתוכה.הערה: כל תמונה של ערכת הנתונים הסינתטית נוצרת על-ידי יצירת מונטאז’ של ארבע תמונות מדומות של 128 פיקסלים x 128 פיקסלים, מה שנותן גודל תמונה סופי של 256 פיקסלים x 256 פיקסלים. ראשית, זה יוצר אריחים בודדים רבים (כ-12,000) הן עבור תמונות המיקרוסקופ (בתיקיית “פלט”) והן עבור סגמנטציות האמת הקרקעית (בתיקיית “פלט/physics_gt”).הגדר את הפרמטרים של מספר האצווה, מספר התמונות לכל אצווה וטווח הרעש ב- “data_generator.py”. הפעל את הקובץ “data_generator.py” כדי ליצור את תמונות המונטאז ‘. העתק את התיקיות בשם “תמונה” ו “קטע” לתוך “5. הכנת נתונים והדרכה / datatrain / רכבת” תיקייה מהתיקיה “5. הכנת נתונים והדרכה/הכנת נתונים/נתונים”. 6. סגמנטציה מבוססת למידה עמוקה אמן את מודל הפילוח על התמונות המדומות באופן הבא:לאימון מודל הפילוח למיקרוסקופ חדש, נווט אל “5. תיקיית הכנת נתונים והדרכה/רכבת”, והגדרת הפרמטרים של גודל האצווה, מודל עמוד השדרה לסגמנטציה, מספר התקופות וקצב הלמידה לאימון בקובץ “train_UNet.py”. הפעל “train_UNet.py” כדי להתחיל את האימון. תהליך האימון מציג את המדד לביצועי הפילוח בערכת האימות המדומה.הערה: לאחר השלמת האימון, המודל נשמר כ- “best_model.h5” ב- “5. תיקיית הכנת נתונים והדרכה/רכבת”. בדוק את המודל על תמונות מיקרוסקופ אמיתיות המפוצלות לגודל הרצוי למודל המאומן באמצעות השלבים הבאים.נווט אל “6. הכן נתוני בדיקה”, והעתק את “. png” קובץ בפורמט של הנתונים לתוך התיקייה “png”. הפעל את הקובץ “split_1024_256.py” כדי לפצל את התמונות לגודל הרצוי עבור המודל המאומן. פעולה זו יוצרת חיתוך בגודל 256 פיקסלים x 256 פיקסלים של התמונות בתיקיית “נתונים”. העתק את התיקייה “נתונים” שנוצרה לתוך “7. בדיקת סגמנטציה” תיקיה. נווט אל התיקיה “7. בדוק סגמנטציה”, והגדר את שם הדגם שנשמר לשימוש. כדי לפלח את היבולים, הפעל את הקובץ “segment.py”. התמונות המקוטעות נשמרות בתיקייה “פלט”. 7. ניתוח מורפולוגי: ניתוח המורפולוגיה המיטוכונדריאלית של שתי קבוצות הנתונים, “גלוקוז” ו-“CCCP” סדר את הנתונים לניתוח (תיקיה אחת לכל תמונה, כאשר כל תיקיה מכילה את חיתוכי הפלט המפולחים של תמונה אחת). הורד והנח את הקובץ המשלים בשם “make_montage.py” בתיקייה בשם “7. סגמנטציה של בדיקות”. הפעל את הקובץ “make_montage.py” כדי לתפור את הפלט המקוטע בחזרה לגודל המקורי של התמונה. צור תיקיה חדשה בשם “9. ניתוח מורפולוגי” בתוך התיקייה “src”. התקן את חבילות Skan16 ו- Seaborn Python לסביבה באמצעות הפקודה “pip install seaborn[stats] skan”.הערה: מסכות הסגמנטציה עוברות שלד באמצעות ספרייה בשם Skan כדי לאפשר ניתוח של הטופולוגיה של כל מיטוכונדריה בנפרד. מקם את הקובץ המשלים ” analyze_mitochondria.py ” לתיקייה “9. ניתוח מורפולוגי”. סדר את התמונות של קבוצות שונות של הניסוי לתוך תיקיות שונות בתוך התיקייה “7. סגמנטציה של בדיקות”. הגדר את הפרמטרים של “גודל פיקסל” ו”נתיב קלט “בקובץ “analyze_mitochondria.py”. הפעל את הקובץ ” analyze_mitochondria.py” כדי להפעיל את הקוד כדי שלד וליצור מגרשים של הניתוח.