Análisis de la morfología mitocondrial a través del aprendizaje supervisado por simulación

NOTA: Las secciones 1-4 pueden omitirse si se trabaja con imágenes de microscopía existentes de mitocondrias con condiciones experimentales conocidas. 1. Cultivo celular Cultive las células H9c2 en DMEM sin glucosa suplementada con 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sodio, 10 mM de galactosa, 10% de FBS, 1% de estreptomicina/penicilina y 1 μg/ml de puromicina. Permita que las células se adapten a la galactosa durante al menos 7 días en cultivo antes de los experimentos.NOTA: Las células H9c2 utilizadas aquí han sido modificadas genéticamente para expresar mitocondrias fluorescentes y también han adquirido un gen de resistencia a la puromicina. La adición de este antibiótico asegura el crecimiento de células con el gen de resistencia y, por lo tanto, mitocondrias fluorescentes. Sembrar las células H9c2 para el experimento cuando la confluencia celular alcance aproximadamente el 80% (matraz de cultivo T75, evaluado por microscopía de campo claro). Precaliente el medio y la tripsina a 37 °C durante al menos 15 minutos antes de continuar.NOTA: Es posible realizar el experimento en paralelo con dos o más condiciones diferentes de cultivo celular. La confluencia de células H9c2 no debe estar por encima del 80% para evitar la pérdida de células mioblásticas. Al 100% de confluencia, las células forman miotubos y comienzan a diferenciarse. Prepárese para sembrar las células, operando en una campana de flujo laminar estéril, colocando un cubreobjetos de vidrio # 1.5 para cada condición experimental en un pozo de una placa de 12 pocillos. Etiquete cada condición y los detalles experimentales en la placa de 12 pocillos. Mover el matraz de cultivo celular de la incubadora a la superficie de trabajo de la campana. Aspirar el medio con un sistema de aspiración o pipeta electrónica, y luego lavar dos veces con 5 ml de PBS (temperatura ambiente). Mueva la tripsina precalentada a la superficie de trabajo y aspire el lavado final de PBS; a continuación, añadir la tripsina precalentada para desprender las células (1 ml para un matraz de cultivo T75). Volver a colocar el matraz de cultivo en la incubadora durante 2-3 min a 37°C. Mueva el medio precalentado a la superficie de trabajo hacia el final de la incubación. Verifique que las células se hayan desprendido con un microscopio de campo claro.Si no se han desprendido todas las células, aplique varios golpecitos cuidadosos pero firmes en el lado del matraz para separar las células restantes. Devolver el matraz de cultivo a la superficie de trabajo. Añadir 4 ml de medio de cultivo celular al matraz de cultivo con una pipeta electrónica para detener la acción de la tripsina. Cuando se añada el medio de cultivo al matraz, utilice la pipeta para dispersar repetidamente el medio por la superficie para separar y reunir las células en una suspensión celular. Pipetear la suspensión celular (5 ml) del matraz a un tubo de 15 ml. Centrifugar las celdas a 200 x g durante 5 min. Abra el tubo en la campana, retire el sobrenadante por aspiración y vuelva a suspender el pellet celular suavemente en 5 ml de medios de cultivo celular. Evalúe el número de células analizando un pequeño volumen de la suspensión celular en un contador de células automatizado. Tenga en cuenta el número de células vivas por mililitro de medios de cultivo. Mover el volumen deseado (por ejemplo, 150 μL por pocillo) de la suspensión celular, calculado para una densidad de siembra de aproximadamente 2 x 104 células/cm2, a un tubo centrífugo de 15 ml premarcado. Agregue el medio de cultivo celular precalentado al tubo de centrífuga de 15 ml a un volumen precalculado basado en el número de pocillos. Para placas de 12 pocillos, use un volumen total de 1 ml para cada pocillo. Asegúrese de que la suspensión de celda diluida se mezcle correctamente pipeteando el contenido del tubo de centrífuga hacia arriba y hacia abajo varias veces antes de dispensar el volumen apropiado a cada pocillo. Una vez que la suspensión celular se dispensa en el pozo, agite la placa de una manera cuidadosamente controlada en cada dirección para distribuir mejor las células a través de los pocillos. Colocar la placa de 12 pocillos en la incubadora a 37°C hasta el día siguiente. Revise las células con un microscopio de campo claro para evaluar el crecimiento. Si las células han logrado un crecimiento suficiente hasta aproximadamente el 80% de confluencia, continúe con los siguientes pasos; De lo contrario, repita la evaluación diariamente hasta que se alcance un crecimiento suficiente. 2. Procedimiento experimental Calcular las cantidades necesarias de los materiales para el experimento de acuerdo con las concentraciones de la solución madre. Descongele los materiales congelados (solución madre CCCP de 30 mM) a 37 °C y ajuste el medio de cultivo celular para precalentarlos a 37 °C. Una vez descongelada, crear una solución de trabajo de CCCP de 10 μM diluyendo la solución madre (1:3.000) en medio de cultivo celular.NOTA: No pipetear volúmenes inferiores a 1 μL. Comience los tratamientos experimentales una vez que todos los materiales necesarios estén preparados y precalentados. Aspirar el medio de cultivo celular de los pocillos de la placa de 12 pocillos y luego aplicar rápidamente el medio fresco precalentado a los pocillos de control y el medio precalentado con solución CCCP de 10 μM a los pocillos de condición de prueba. Incubar la placa de 12 pocillos en la incubadora de células a 37 °C durante 2 h. Durante el período de incubación, prepare la solución de fijación. Para la preparación de la solución de fijación, use paraformaldehído (PFA) al 4% prefabricado para diluir la solución madre de glutaraldehído (GA) al 25% (GA) al 0,2% (1:125). Ajuste la solución para precalentar a 37 °C. Para una placa de 12 pocillos, 500 μL es suficiente por pocillo.PRECAUCIÓN: PFA y GA son sustancias químicas tóxicas. Trabaje en una campana química con equipo de protección. Consulte sus respectivas SDS para obtener más detalles. Cuando finalice el período de incubación, retire la placa de 12 pocillos de la incubadora y colóquela en la superficie de trabajo.NOTA: El trabajo ya no requiere un ambiente estéril. Aspirar el medio de cultivo celular de los pocillos y aplicar la solución de fijación precalentada. Devolver la placa de 12 pocillos a la incubadora a 37 °C durante 20 min. Aspirar la solución de fijación al completar la incubación y lavar cada pocillo dos veces con PBS a temperatura ambiente. Es posible pausar el experimento en esta etapa del protocolo y continuar más tarde.Si el experimento está en pausa, agregue 1 ml de PBS por pocillo, selle la placa de 12 pocillos con una película de plástico (parapelícula) y guárdela a 4 ° C. 3. Tinción y montaje de las celdas en los cubreobjetos Descongele el material DAPI (tinción nuclear) y gire hacia abajo en una mini centrífuga antes de abrir. Prepare la solución de tinción DAPI diluyendo el stock de DAPI en PBS (1:1.000). Aspire el PBS de la placa de 12 pocillos y aplique 1 ml de solución de tinción DAPI en cada pocillo. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 5 min. Aspire la solución de tinción DAPI. Lave dos veces con 2 ml de PBS por pocillo. Prepare portaobjetos de microscopio de vidrio esmerilado (portaobjetos de vidrio) lavándolos en etanol al 70%, seguido de tres lavados en PBS. Seque cuidadosamente los portaobjetos con toallas de papel sin pelusa y diríjalos hacia la luz para verificar si hay signos de polvo o grasa.NOTA: Se requieren guantes para este paso. Etiquete las diapositivas de vidrio con los detalles experimentales. Transfiera el medio de montaje a un tubo de microcentrífuga y gire hacia abajo en una mini centrífuga. Prepárese para montar los cubreobjetos organizando el espacio de trabajo. Mantenga lista una placa de 12 pocillos con cubreobjetos, portaobjetos de vidrio etiquetados, medio de montaje, una pipeta, puntas de pipeta de 10 μL, toallas de papel sin pelusa y pinzas. Aplique 10 μL de medio de montaje (vidrio ProLong) a un portaobjetos de vidrio preparado para montar un cubreobjetos. Recoja el cubreobjetos de la placa de 12 pocillos con unas pinzas y aplique la humedad del cubreobjetos tocando brevemente el borde y la parte posterior del cubreobjetos con la toalla de papel sin pelusa preparada. Baje suavemente el cubreobjetos hacia abajo sobre la gota del medio de montaje. Repita los dos pasos anteriores para cada cubreobjetos. Coloque las gotas medianas de montaje para permitir entre uno y cuatro cubreobjetos por portaobjetos de vidrio. Asegúrese de que las guías de vidrio estén sobre una superficie plana para evitar que los cubreobjetos montados se muevan. Coloque las guías de vidrio en un lugar oscuro a temperatura ambiente durante la noche para permitir que el medio de montaje se asiente. Las muestras ya están listas para la obtención de imágenes. El experimento puede pausarse en esta etapa del protocolo y continuar más tarde. Si el experimento se detiene en esta etapa, después de haber permitido que las muestras se fijen durante la noche a temperatura ambiente, cúbralas con papel de aluminio para protegerlas de la luz y guárdelas a 4 ° C. 4. Microscopía e imagen Cubra las muestras con papel de aluminio para el transporte (si aún no lo ha hecho). Al llegar a la instalación de microscopía, use H2O de doble destilación con papel de filtro de microscopio para limpiar los residuos de PBS de los cubreobjetos de los portaobjetos de vidrio. Verifique que no haya manchas en los cubreobjetos sosteniendo las diapositivas de vidrio hacia una luz brillante. Siga el procedimiento de inicio para el microscopio. Seleccione el objetivo apropiado (Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil M27), y añada el medio de inmersión. Coloque la muestra en el portamuestras. Dentro del software del microscopio, use la pestaña “Localizar” para activar la iluminación de fluorescencia EGFP y, usando los oculares, ajuste manualmente el nivel z para enfocar la muestra. Apague la iluminación de fluorescencia al encontrar el foco. Cambie a la pestaña “Adquirir” dentro del software del microscopio. Utilice la “Configuración inteligente” para seleccionar los canales de fluorescencia que se utilizarán para la obtención de imágenes. Para este experimento, se seleccionaron los ajustes preestablecidos de canal EGFP y DAPI. Ajuste la intensidad de cada canal desde la configuración inicial utilizando el histograma de intensidad como guía para optimizar la intensidad de la señal. Las imágenes ahora pueden comenzar. Para obtener imágenes, utilice la opción del software para colocar las posiciones de imagen en una matriz y centrar la matriz en el centro del cubreobjetos con 12 posiciones totales para obtener imágenes. Compruebe que cada posición de la matriz contiene celdas. Si no hay celdas, ajuste la posición a un área con celdas. Ajuste el enfoque de cada posición en la matriz utilizando el enfoque automático del software del microscopio, y siga esto con un ajuste fino manual para garantizar que tantas mitocondrias como sea posible estén enfocadas.NOTA: El canal EGFP se utiliza para estos ajustes manuales. Obtenga las imágenes utilizando este método para cada cubreobjetos. Guarde los archivos de imagen y continúe con los pasos para el análisis morfológico. 5. Generación de datos de entrenamiento simulados Descargue el código10 y descomprima el contenido. Siga las instrucciones de README.md para configurar el entorno requerido. Navegue a la carpeta llamada “src”, que es la carpeta de inicio de este proyecto. Las carpetas numeradas en el interior contienen códigos que son específicos de los diferentes pasos del uso de la herramienta.Nota : utilice el comando “cd <>” para navegar a cualquier subcarpeta del código. Para ejecutar cualquier archivo python, use el comando “python <>.py”. La presentación denominada “Tutorial.pptx” contiene un conjunto completo de instrucciones para utilizar el modelo de segmentación. Haga una copia o use la carpeta “2. Mitochondria Simulation Airy”, y cámbiele el nombre (Airy se usa aquí ya que es la función PSF más cercana a un microscopio confocal, que se usó como el microscopio actual). Vaya a la carpeta llamada “simulador”.NOTA: Esta carpeta contiene todos los archivos relacionados con la simulación de los datos de entrenamiento. Hay tres conjuntos de parámetros que se establecerán para la simulación. Primero, para el simulador en el archivo de configuración por lotes “simulador / lote / bxx.csv”, establezca los parámetros para aproximadamente la muestra, incluido el número de mitocondrias, el rango de diámetros y las longitudes de las estructuras, el rango del eje z que exhibe la estructura y la densidad de los fluoróforos. A continuación, establezca los parámetros relacionados con el sistema óptico.Este conjunto incluye el tipo de microscopio (que determina qué modelo de PSF se selecciona), la apertura numérica (N.A.), el aumento (M), el tamaño de píxel (en μm), la longitud de onda de emisión de los fluoróforos y el parámetro de ruido de fondo, etc. Establezca los parámetros ópticos de N.A., el aumento y la longitud de onda mínima del conjunto de datos en el archivo “simulador/microscPSFmod.py”. Establezca el valor deseado para el tamaño de píxel y establezca la longitud de onda de emisión del conjunto de datos como parámetro para la función “process_matrix_all_z” en el archivo “simulador / generate_batch_parallel.py”. Establezca los últimos tres parámetros de la función “save_physics_gt” en el archivo “simulador / generate_batch_parallel.py”. Los parámetros son el tamaño de píxel (en nm), el tamaño de la imagen de salida y max_xy. Establezca el tercer conjunto de parámetros con respecto al conjunto de datos de salida, como el tamaño de las imágenes de salida, el número de mosaicos en cada imagen y el número de imágenes totales, en el archivo “simulador / generate_batch_parallel.py”. Ejecute el archivo “simulador/generate_batch_parallel.py” para iniciar la simulación. Para obtener la imagen de tamaño final, haga una copia de la carpeta denominada “5. Preparación de datos y Capacitación / preparación de datos” en la carpeta de inicio, y navegue hasta ella.NOTA: Cada imagen del conjunto de datos sintéticos se forma creando un montaje de cuatro imágenes simuladas de 128 píxeles x 128 píxeles, lo que da un tamaño de imagen final de 256 píxeles x 256 píxeles. Esto primero genera muchas teselas individuales (alrededor de 12,000) tanto para las imágenes del microscopio (en la carpeta “salida”) como para las segmentaciones de la verdad del suelo (en la carpeta “salida / physics_gt”).Establezca los parámetros del número de lote, el número de imágenes por lote y el rango de ruido en “data_generator.py”. Ejecute el archivo “data_generator.py” para crear las imágenes de montaje. Copie las carpetas llamadas “imagen” y “segmento” en el “5. Preparación de datos y formación/datatrain/train” de la carpeta “5. Preparación y formación de datos/preparación de datos/datos”. 6. Segmentación basada en el aprendizaje profundo Entrene el modelo de segmentación en las imágenes simuladas de la siguiente manera:Para entrenar el modelo de segmentación para un nuevo microscopio, navegue hasta el “5. Preparación de datos y entrenamiento/entrenamiento”, y establezca los parámetros del tamaño del lote, el modelo de columna vertebral para la segmentación, el número de épocas y la tasa de aprendizaje para la capacitación en el archivo “train_UNet.py”. Ejecute “train_UNet.py” para iniciar el entrenamiento. El proceso de entrenamiento muestra la métrica para el rendimiento de la segmentación en el conjunto de validación simulado.NOTA: Una vez completado el entrenamiento, el modelo se guarda como “best_model.h5” en el “5. Preparación de datos y formación/formación”. Pruebe el modelo en imágenes de microscopio reales que se dividen a un tamaño que sea deseable para el modelo entrenado a través de los siguientes pasos.Vaya a “6. Prepare los datos de prueba” y copie el archivo “. PNG” formatea los archivos de los datos en la carpeta “PNG”. Ejecute el archivo “split_1024_256.py” para dividir las imágenes a un tamaño que sea deseable para el modelo entrenado. Esto crea recortes de tamaño de 256 píxeles x 256 píxeles de las imágenes en la carpeta “datos”. Copie la carpeta “data” creada en el “7. Segmentación de pruebas”. Navegue a la carpeta “7. Segmentación de prueba” y establezca el nombre del modelo guardado que se utilizará. Para segmentar los cultivos, ejecute el archivo “segment.py”. Las imágenes segmentadas se guardan en la carpeta “salida”. 7. Análisis morfológico: Análisis de la morfología mitocondrial de los dos grupos de datos, “Glucosa” y “CCCP” Organice los datos a analizar (una carpeta para cada imagen, con cada carpeta que contiene los recortes de salida segmentados de una imagen). Descargue y coloque el archivo complementario llamado “make_montage.py” en la carpeta llamada “7. Segmentación de pruebas”. Ejecute el archivo “make_montage.py” para volver a unir la salida segmentada al tamaño original de la imagen. Cree una nueva carpeta denominada “9. Análisis Morfológico” dentro de la carpeta “src”. Instale los paquetes Skan16 y Seaborn Python en el entorno utilizando el comando “pip install seaborn[stats] skan”.NOTA: Las máscaras de segmentación están esqueletizadas utilizando la biblioteca llamada Skan para permitir el análisis de la topología de cada mitocondria individual. Coloque el archivo complementario ” analyze_mitochondria.py ” en la carpeta “9. Análisis Morfológico”. Organice las imágenes de diferentes grupos del experimento en diferentes carpetas dentro de la carpeta “7. Segmentación de pruebas”. Establezca los parámetros de “tamaño de píxel” y “ruta de entrada” en el archivo “analyze_mitochondria.py”. Ejecute el archivo ” analyze_mitochondria.py” para ejecutar el código para esqueletizar y crear gráficos del análisis.