Mitokondriyal Morfolojinin Simülasyon Denetimli Öğrenme Yoluyla Analiz Edilmesi
Summary
Bu makalede, sabit hücrelerin floresan mikroskopi görüntülerinde mitokondri morfolojisini analiz etmek için simülasyon denetimli makine öğreniminin nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır.
Abstract
Hücre floresan mikroskobu görüntülerinde mitokondri gibi hücre altı organellerin kantitatif analizi, bu küçük ve morfolojik olarak çeşitli yapıların segmentasyonundaki doğal zorluklar nedeniyle zorlu bir görevdir. Bu makalede, sabit hücrelerin floresan mikroskopi görüntülerinde mitokondriyal morfolojinin nicelleştirilmesi için makine öğrenimi destekli bir segmentasyon ve analiz boru hattının kullanımını göstereceğiz. Derin öğrenme tabanlı segmentasyon aracı, simüle edilmiş görüntüler üzerinde eğitilmiştir ve denetimli derin öğrenme için temel doğruluk ek açıklamaları gereksinimini ortadan kaldırır. Bu aracın, floresan mitokondri belirteçlerinin kararlı bir ekspresyonu ile sabit kardiyomiyoblastların floresan mikroskopi görüntüleri üzerindeki faydasını gösteriyoruz ve mitokondriyal morfolojide değişiklikleri indüklemek için spesifik hücre kültürü koşullarını kullanıyoruz.
Introduction
Bu yazıda, floresan mitokondri belirteçlerini eksprese eden sabit kardiyomiyoblastların floresan mikroskopi görüntülerinde hücre altı segmentasyon1 için fizik tabanlı bir makine öğrenme aracının faydasını göstereceğiz.
Mitokondri, memeli hücrelerinde ana enerji üreten organellerdir. Spesifik olarak, mitokondri oldukça dinamik organellerdir ve genellikle uzunluk ve dallanma bakımından sürekli değişen ağlarda bulunur. Mitokondrinin şekli işlevlerini etkiler ve hücreler ortamdaki bir değişikliğe uyum sağlamak için mitokondriyal morfolojilerini hızla değiştirebilir2. Bu fenomeni anlamak için, mitokondrinin noktalar, çubuklar veya ağlar olarak morfolojik sınıflandırması oldukça bilgilendiricidir3.
Mitokondrinin segmentasyonu, hücrelerdeki mitokondriyal morfolojinin analizi için çok önemlidir. Mitokondrinin floresan mikroskopi görüntülerini segmentlere ayırmak ve analiz etmek için mevcut yöntemler, manuel segmentasyona veya geleneksel görüntü işleme yaklaşımlarına dayanmaktadır. Otsu4 gibi eşik tabanlı yaklaşımlar, mikroskopi görüntülerindeki yüksek gürültü seviyeleri nedeniyle daha az doğrudur. Tipik olarak, mitokondrinin morfolojik analizi için görüntüler çok sayıda mitokondri içerir ve bu da manuel segmentasyonu sıkıcı hale getirir. MorphoLibJ5 gibi matematiksel yaklaşımlar ve Weka6 gibi yarı denetimli makine öğrenimi yaklaşımları oldukça talepkardır ve uzman bilgisi gerektirir. Mitokondri7 için görüntü analizi tekniklerinin gözden geçirilmesi, derin öğrenme tabanlı tekniklerin görev için yararlı olabileceğini göstermiştir. Gerçekten de, kendi kendine sürüş gibi uygulamalar için günlük yaşam görüntülerinde görüntü segmentasyonu, derin öğrenme tabanlı modellerin kullanılmasıyla devrim yarattı.
Derin öğrenme, büyük miktarda veriden öğrenen algoritmalar sağlayan makine öğreniminin bir alt kümesidir. Denetimli derin öğrenme algoritmaları, temel doğruluk (GT) etiketleriyle açıklama eklenmiş büyük görüntü kümelerinden ilişkileri öğrenir. Floresan mikroskopi görüntülerinde mitokondrileri segmentlere ayırmak için denetimli derin öğrenmenin kullanılmasındaki zorluklar iki katlıdır. İlk olarak, denetimli derin öğrenme, büyük bir eğitim görüntüleri veri kümesi gerektirir ve floresan mikroskobu durumunda, bu büyük veri kümesini sağlamak, daha kolay kullanılabilir geleneksel kamera tabanlı görüntülerin kullanıldığı zamana kıyasla kapsamlı bir görev olacaktır. İkincisi, floresan mikroskopi görüntüleri, eğitim görüntülerindeki ilgili nesnelerin GT ek açıklamalarını gerektirir; bu, uzman bilgisi gerektiren sıkıcı bir iştir. Bu görev, floresan olarak etiketlenmiş hücre altı yapılara sahip hücrelerin tek bir görüntüsü için uzmanın zamanının saatlerini veya günlerini kolayca alabilir. Ayrıca, ek açıklamalar arasındaki farklılıklar bir sorun teşkil eder. Manuel ek açıklama ihtiyacını ortadan kaldırmak ve derin öğrenme tekniklerinin üstün performansından yararlanabilmek için, burada simüle edilmiş görüntüler üzerinde eğitilmiş derin öğrenme tabanlı bir segmentasyon modeli kullanılmıştır. Fizik tabanlı simülatörler, mikroskopta görüntü oluşum sürecini taklit etmek ve kontrol etmek için bir yol sağlar ve bilinen şekillerin görüntülerinin oluşturulmasına izin verir. Fizik tabanlı bir simülatör kullanarak, bu amaçla mitokondrinin simüle edilmiş floresan mikroskopi görüntülerinden oluşan büyük bir veri kümesi oluşturuldu.
Simülasyon, şekil oluşturma için parametrik eğriler kullanarak geometri oluşturma ile başlar. Yayıcılar, şeklin yüzeyine, yoğunluk deneysel değerlerle eşleşecek şekilde eşit olarak dağıtılmış bir şekilde rastgele yerleştirilir. Mikroskobun 3B nokta yayılma fonksiyonu (PSF), Gibson-Lanni model9’un hesaplama açısından verimli bir yaklaşımı8 kullanılarak hesaplanır. Simüle edilmiş görüntüleri deneysel görüntülerle yakından eşleştirmek için, hem karanlık akım hem de çekim gürültüsü, fotoğraf gerçekçiliği elde etmek için taklit edilir. Fiziksel GT, ikili bir harita şeklinde oluşturulur. Veri kümesini oluşturma ve simülasyon modelini eğitme kodu10 kullanılabilir ve bu sanal veri kümesini oluşturma adımı Şekil 1’de özetlenmiştir.
Sabit kardiyomiyoblastların konfokal mikroskopi görüntülerini analiz ederek tamamen simüle edilmiş bir veri kümesi üzerinde eğitilmiş derin öğrenme tabanlı segmentasyonun faydasını sergiliyoruz. Bu kardiyomiyoblastlar, mitokondriyal dış zarda bir floresan belirteci ifade ederek, floresan mikroskobu görüntülerinde mitokondrinin görselleştirilmesine izin verdi. Burada örnek olarak verilen deneyi yapmadan önce, hücreler glikozdan mahrum bırakıldı ve kültürde 7 gün boyunca galaktoza adapte edildi. Büyüme ortamındaki glikozun galaktoz ile değiştirilmesi, kültürdeki hücreleri daha oksidatif olmaya zorlar ve böylece enerji üretimi için mitokondrilerine bağımlı hale gelir11,12. Ayrıca, bu hücreleri mitokondriyal hasara karşı daha hassas hale getirir. Mitokondriyal morfoloji değişiklikleri, hücre kültürü ortamı13’e karbonil siyanür m-klorofenil hidrazon (CCCP) gibi bir mitokondriyal ayırma ajanı eklenerek deneysel olarak indüklenebilir. CCCP, mitokondriyal membran potansiyeli (ΔΨm) kaybına yol açar ve böylece mitokondride daha tübüler (çubuk benzeri) bir morfolojiden daha küresel (nokta benzeri) bir morfolojiye14 kadar değişikliklere neden olur. Ek olarak, mitokondri CCCP tedavisi sırasında şişme eğilimindedir15. Galaktoza adapte olmuş kardiyomiyoblastlar mitokondriyal uncoupler CCCP ile tedavi edildiğinde mitokondri değişikliklerinin morfolojik dağılımını gösteriyoruz. Mitokondrinin derin öğrenme segmentasyonları, onları noktalar, çubuklar veya ağlar olarak sınıflandırmamızı sağladı. Daha sonra farklı mitokondriyal fenotiplerin dal uzunluklarını ve bolluğunu değerlendirmek için nicel metrikler elde ettik. Analizin adımları Şekil 2’de özetlenmiştir ve hücre kültürü, görüntüleme, derin öğrenme tabanlı segmentasyon için veri kümesi oluşturma ve mitokondrinin nicel analizinin ayrıntıları aşağıda verilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokoldeki kritik adımlarla ilgili önlemleri “geometri üretimi” ve “simülatör parametreleri” ile ilgili paragraflarda tartışıyoruz. “Transfer öğrenme” başlıklı paragraf, çoklu mikroskoplara adapte olurken daha yüksek verim için yapılan değişiklikleri tartışmaktadır. “Parçacık analizi” ve “diğer hücre altı yapıların oluşturulması” ile ilgili paragraflar, bu yöntemin gelecekteki uygulamalarına atıfta bulunmaktadır. “Biyolojik gerçeklikten fark” ile ilgili paragraf, simülasyonların gerçek verilerden farklı olmasının farklı nedenlerini ve bu nedenlerin uygulamamızı etkileyip etkilemediğini tartışmaktadır. Son olarak, “yoğun paketlenmiş yapılar” paragrafında yöntemimiz için zorlu bir senaryoyu tartışıyoruz.
Geometri oluşturma
Mitokondrinin 3B geometrisini oluşturmak için, iskeletler olarak b-spline eğrilerinden oluşturulan basit bir 2B yapı, sentetik veri kümesinin oluşturulması için iyi çalışır. Bu sentetik şekiller, 2D hücre kültürlerinde gözlenen mitokondri şekillerini yakından taklit eder. Bununla birlikte, kalp dokusu gibi 3D dokular söz konusu olduğunda, mitokondrinin şekli ve düzenlenmesi oldukça farklıdır. Bu gibi durumlarda, segmentasyon modelinin performansı, simüle edilen görüntülere yönsellik eklenmesiyle iyileşebilir.
Simülatör parametreleri
Simülatörün parametrelerini ayarlarken, çıkarımı çalıştıracak verilerinkilerle eşleştiklerinden emin olmak için dikkatli olunmalıdır, çünkü bunun yapılmaması segmentasyonda daha düşük performansa neden olabilir. Bu parametrelerden biri sinyal-gürültü oranı (SNR) aralığıdır. Test edilecek verilerin SNR aralığı, benzetimli veri kümesinin değerleriyle eşleşmelidir. Ayrıca, kullanılan PSF hedef test verilerininkiyle eşleşmelidir. Örneğin, konfokal PSF’den model tarafından eğitilmiş görüntüler, epi-floresan mikroskoptan gelen görüntüleri test etmek için kullanılmamalıdır. Dikkat edilmesi gereken bir diğer parametre, test verilerinde ek büyütme kullanılmasıdır. Test verilerinde ek büyütme kullanılmışsa, simülatör de uygun şekilde ayarlanmalıdır.
Transfer öğrenme
Transfer öğrenme, başka bir görevde kullanılmak üzere bir görevde eğitilmiş öğrenilmiş bir modelden yararlanma olgusudur. Bu fenomen, farklı mikroskop verisi türleriyle ilgili sorunumuz için de geçerlidir. Bir tür mikroskopi verisi üzerinde eğitilen segmentasyon modelinin ağırlıkları (kaynak koduyla birlikte verilir), başka bir optik mikroskop verisi türünde kullanılacak bir segmentasyon modelini başlatmak için kullanılabilir. Bu, eğitim veri kümesinin önemli ölçüde daha küçük bir alt kümesi (10.000’e kıyasla 3.000 görüntü) üzerinde eğitim yapmamızı sağlar, böylece simülasyonun hesaplama maliyetlerini azaltır.
Partikül analizi
Partikül analizi, parçalı maskeler üzerinde de yapılabilir. Bu, bireysel mitokondrinin alanı ve eğriliği vb. Hakkında bilgi sağlayabilir. Bu bilgi aynı zamanda mitokondrinin nicel karşılaştırması için metrik olarak da hizmet edebilir (bu deney için kullanılmaz). Örneğin, şu anda, nokta morfolojisini, mitokondrinin uzunluğuna dayanan bir eşik kullanarak tanımlıyoruz. Bazı durumlarda, küçük çubuk benzeri mitokondrileri puncta veya nokta benzeri mitokondriden daha iyi ayırmak için eliptikliği dahil etmek yararlı olabilir. Alternatif olarak, bazı biyolojik koşullar mitokondrinin kıvrılmasına neden olursa, mitokondriyal popülasyonu analiz etmek için eğrilik nicelemesi ilgi çekici olabilir.
Diğer hücre altı yapıların oluşturulması
Hücre altı yapıların fizik temelli segmentasyonu mitokondri ve veziküller1 için gösterilmiştir. Veziküller farklı şekiller sergilese de, boyutları daha küçüktür ve bir floresan mikroskobu ile gözlemlendiğinde basit küreler olarak görünürler. Bu nedenle, veziküllerin geometrisi, uygun bir çap aralığındaki küresel yapılar kullanılarak simüle edilir. Bu, fonksiyondaki bir değişikliğin, yapıların geometrisini (mitokondri durumunda silindirler ve veziküller durumunda küreler) ve ilgili parametreleri (protokol bölümünde adım 5.4) ürettiği anlamına gelir. Geometrik olarak, endoplazmik retikulum ve mikrotübüller de boru şeklindeki yapılar olarak simüle edilmiştir17. Endoplazmik retikulumun 150 nm çapında ve mikrotübüllerin ortalama dış çapı 25 nm ve iç içi boş tüpün 15 nm çapında modellenmesi, bu yapıların şekillerinin yaklaşık olarak anlaşılmasını sağlar. Bu hücre altı yapıların her biri için değişecek bir başka parametre de florofor yoğunluğudur. Bu, floroforların bağlandığı biyomolekülün dağılımına ve bağlanma olasılığına göre hesaplanır.
Biyolojik zemin gerçeğinden farkı
Derin öğrenme modelinin simülasyon denetimli eğitimi için kullanılan simüle edilmiş veriler, gerçek verilerden birçok yönden farklıdır. (i) Simüle edilen verilerde spesifik olmayan etiketlemenin olmaması, gerçek verilerde genellikle serbest yüzen floroforlar bulunduğundan, gerçek verilerden farklıdır. Bu, gerçek görüntüde daha yüksek bir ortalama arka plan değerine neden olur. Bu fark, SNR ile eşleştirilerek ve arka plan değeri gözlemlenen gerçek değerlerle eşleşecek şekilde ayarlanarak azaltılır. (ii) Hücre altı yapıların hareketi ve fotokinetik, sistemdeki iki dinamik kaynağıdır. Canlı hücrelerdeki hareketli yapılar (birkaç milisaniye aralığında hareket eden) hareket bulanıklığına neden olur. Bulanıklaştırma etkisinden kaçınmak için gerçek veri toplama sırasında pozlama süresi kısalır. Öte yandan, zaman atlamayı simüle etmiyoruz ve hareketsiz yapıları varsaymıyoruz; Bu varsayım, gerçek verilerdeki maruz kalma süresi küçük olduğunda geçerlidir. Bununla birlikte, bu varsayım, gerçek verilerin pozlama süresi hareket bulanıklığına neden olacak kadar büyükse, çıktıda bir hataya neden olabilir. Öte yandan, fotokinetik, nanosaniyeler ila mikrosaniyeler arasındadır ve simülasyonda atlanabilir, çünkü deneylerin olağan maruz kalma süreleri, fotokinetiğin etkilerini ortalamak için yeterince uzundur (milisaniye sırasına göre). (iii) Mikroskop görüntülerindeki gürültünün farklı kaynakları vardır ve bu kaynakların farklı olasılık yoğunluğu fonksiyonları vardır. Bu bireysel gürültü kaynaklarını modellemek yerine, sabit bir arka plan üzerinde Gauss gürültüsü olarak yaklaşıyoruz. Bu fark, düşük sinyal-arka plan oranı koşulları (2-4 aralığında) ve floroforların makro yoğunluğu 1 ile uğraşırken veri dağılımını önemli ölçüde değiştirmez. (iv) Görüntülemedeki eserler sapmalardan, sürüklenmelerden ve sistematik bulanıklıklardan kaynaklanabilir. Mikroskobun iyi hizalandığını ve gerçek verilerde analiz için seçilen bölgelerin bu eserlerden yoksun olduğunu varsayıyoruz. Bu eserlerin bazılarını PSF 18,19,20’de modelleme olasılığı da vardır.
Yoğun paketlenmiş yapılar
Çakışan çubukları ağlardan ayırt edememenin zorlukları, 2D mikroskopi verilerinin segmentasyonunda kalıcı bir sorundur. Mitokondrilerin yoğun bir şekilde paketlendiği Şekil 5’te son derece zorlu bir senaryo sunulmuştur, bu da segmentasyon modelinde ve aşağıdaki analizde optimal olmayan sonuçlara yol açmaktadır. Bu zorluğa rağmen, iskeletleşmeyi inceltmek için bu gibi durumlarda morfolojik operatörlerin kullanılması, tüm mitokondriyal morfoloji kategorilerinde önemli değişikliklerin hala tespit edilmesine izin verirken, bu aşırı bağlı ağların kırılmasına yardımcı olabilir. Ek olarak, görüntüleme için geniş alan mikroskobu yerine konfokal bir mikroskop kullanılması, odak dışı ışığı ortadan kaldırarak bu sorunu kısmen hafifletmek için bir yöntemdir. Ayrıca, gelecekte, kesişen (yani fiziksel olarak bir ağ oluşturan) mitokondrileri, tek bir düzlemdeki projeksiyonları birbiriyle örtüşen çubuk benzeri mitokondriden ayırt etmek için 3B segmentasyon yapmak yararlı olacaktır.
Derin öğrenme segmentasyonu, mikroskopi kullanıcılarının analiz yeteneklerini genişletmeyi teklif eden, böylece daha önce yönetilemeyen karmaşık verilerin ve büyük nicel veri kümelerinin otomatik analizini yapma olasılığını açan umut verici bir araçtır.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Arif Ahmed Sekh ile yapılan tartışmayı kabul ediyorlar. Zambarlal Bhujabal, kararlı H9c2 hücrelerinin oluşturulmasına yardımcı olduğu için kabul edilmektedir. Aşağıdaki fonları kabul ediyoruz: ERC başlangıç hibesi no. 804233 (K.A.’ya), Bilimsel Yenileme için Araştırmacı Projesi hibe no. 325741 (D.K.P.’ye), Kuzey Norveç Bölgesel Sağlık Otoritesi hibe no. HNF1449-19 (Å.B.B.) ve UiT’in Cristin Project ID 2061348 ile tematik finansman projesi VirtualStain (D.K.P., Å.B.B., K.A. ve A.H.).
Materials
| 12-well plate | FALCON | 353043 | |
| Aqueous Glutaraldehyde EM Grade 25% | Electron Microscopy Sciences | 16200 | |
| Axio Vert.A1 | Zeiss | Brightfield microscope | |
| CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 | |
| Computer | n/a | n/a | Must be running Linux/Windows Operating System having an NVIDIA GPU with at least 4GB of memory |
| Coverslips | VWR | 631-0150 | |
| DAPI (stain) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| DMEM | gibco | 11966-025 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Glass Slides (frosted edge) | epredia | AA00000112E01MNZ10 | |
| H9c2 mCherry-EGFP-OMP25 | In-house stable cell line derived from purchased cell line | ||
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51033557 | |
| LSM 800 | Zeiss | Confocal Microscope | |
| Mounting Media (Glass) | Thermo Fisher Scientific | P36980 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Thermo Fisher Scientific | J19943-K2 | |
| Plan-Apochromat 63x oil (M27) objective with an NA of 1.4 | Zeiss | 420782-9900-000 | |
| Sterile laminar flow hood | Labogene | SCANLAF MARS | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Vacusafe aspiration system | VACUUBRAND | 20727400 | |
| ZEN 2.6 | Zeiss |
References
- Sekh, A. A., et al. Physics-based machine learning for subcellular segmentation in living cells. Nature Machine Intelligence. 3, 1071-1080 (2021).
- Pernas, L., Scorrano, L. Mito-morphosis: Mitochondrial fusion, fission, and cristae remodeling as key mediators of cellular function. Annual Review of Physiology. 78, 505-531 (2016).
- Li, Y., et al. Imaging of macrophage mitochondria dynamics in vivo reveals cellular activation phenotype for diagnosis. Theranostics. 10 (7), 2897-2917 (2020).
- Xu, X., Xu, S., Jin, L., Song, E. Characteristic analysis of Otsu threshold and its applications. Pattern Recognition Letters. 32 (7), 956-961 (2011).
- MorphoLibJ: MorphoLibJ v1.2.0. Zenodo Available from: https://zenodo.org/record/50694#.Y8qfo3bP23A (2016)
- Trainable_Segmentation: Release v3.1.2. Zenodo Available from: https://zenodo.org/record/59290#.Y8qf13bP23A (2016)
- Chu, C. H., Tseng, W. W., Hsu, C. M., Wei, A. C. Image analysis of the mitochondrial network morphology with applications in cancer research. Frontiers in Physics. 10, 289 (2022).
- Xue, F., Li, J., Blu, T. Fast and accurate three-dimensional point spread function computation for fluorescence microscopy. Journal of the Optical Society of America A. 34 (6), 1029-1034 (2017).
- Lanni, F., Gibson, S. F. Diffraction by a circular aperture as a model for three-dimensional optical microscopy. Journal of the Optical Society of America A. 6 (9), 1357-1367 (1989).
- Sekh, A. A., et al. Physics based machine learning for sub-cellular segmentation in living cells. Nature Machine Intelligence. 3, 1071-1080 (2021).
- Liu, Y., Song, X. D., Liu, W., Zhang, T. Y., Zuo, J. Glucose deprivation induces mitochondrial dysfunction and oxidative stress in PC12 cell line. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 7 (1), 49-56 (2003).
- Dott, W., Mistry, P., Wright, J., Cain, K., Herbert, K. E. Modulation of mitochondrial bioenergetics in a skeletal muscle cell line model of mitochondrial toxicity. Redox Biology. 2, 224-233 (2014).
- Ishihara, N., Jofuku, A., Eura, Y., Mihara, K. Regulation of mitochondrial morphology by membrane potential, and DRP1-dependent division and FZO1-dependent fusion reaction in mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 301 (4), 891-898 (2003).
- Miyazono, Y., et al. Uncoupled mitochondria quickly shorten along their long axis to form indented spheroids, instead of rings, in a fission-independent manner. Scientific Reports. 8, 350 (2018).
- Ganote, C. E., Armstrong, S. C. Effects of CCCP-induced mitochondrial uncoupling and cyclosporin A on cell volume, cell injury and preconditioning protection of isolated rabbit cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 35 (7), 749-759 (2003).
- Nunez-Iglesias, J., Blanch, A. J., Looker, O., Dixon, M. W., Tilley, L. A new Python library to analyse skeleton images confirms malaria parasite remodelling of the red blood cell membrane skeleton. PeerJ. 2018, 4312 (2018).
- Sage, D., et al. Super-resolution fight club: Assessment of 2D and 3D single-molecule localization microscopy software. Nature Methods. 16, 387-395 (2019).
- Yin, Z., Kanade, T., Chen, M. Understanding the phase contrast optics to restore artifact-free microscopy images for segmentation. Medical Image Analysis. 16 (5), 1047-1062 (2012).
- Malm, P., Brun, A., Bengtsson, E. Simulation of bright-field microscopy images depicting pap-smear specimen. Cytometry. Part A. 87 (3), 212-226 (2015).
- Bifano, T., Ünlü, S., Lu, Y., Goldberg, B. Aberration compensation in aplanatic solid immersion lens microscopy. Optical Express. 21 (23), 28189-28197 (2013).
