AMEBaS: Automatische Mittellinienextraktion und Hintergrundsubtraktion von ratiometrischen Fluoreszenz-Zeitraffern polarisierter Einzelzellen
Summary
Derzeitige Methoden zur Analyse der intrazellulären Dynamik polarisierter Einzelzellen sind oft manuell und nicht standardisiert. Dieses Manuskript stellt eine neuartige Bildanalyse-Pipeline zur Automatisierung der Mittellinienextraktion einzelner polarisierter Zellen und zur Quantifizierung des raumzeitlichen Verhaltens aus Zeitraffern in einer benutzerfreundlichen Online-Oberfläche vor.
Abstract
Zellpolarität ist ein makroskopisches Phänomen, das durch eine Ansammlung von räumlich konzentrierten Molekülen und Strukturen entsteht, die in der Entstehung spezialisierter Domänen auf subzellulärer Ebene gipfeln. Es ist mit der Entwicklung asymmetrischer morphologischer Strukturen verbunden, die wichtigen biologischen Funktionen wie Zellteilung, Wachstum und Migration zugrunde liegen. Darüber hinaus wurde die Störung der Zellpolarität mit gewebebezogenen Erkrankungen wie Krebs und Magendysplasie in Verbindung gebracht.
Derzeitige Methoden zur Bewertung der raumzeitlichen Dynamik von fluoreszierenden Reportern in einzelnen polarisierten Zellen beinhalten oft manuelle Schritte, um eine Mittellinie entlang der Hauptachse der Zellen zu verfolgen, was zeitaufwändig und anfällig für starke Verzerrungen ist. Obwohl die ratiometrische Analyse die ungleichmäßige Verteilung von Reportermolekülen mit Hilfe von zwei Fluoreszenzkanälen korrigieren kann, sind die Techniken der Hintergrundsubtraktion häufig willkürlich und nicht statistisch abgesichert.
Dieses Manuskript stellt eine neuartige Rechenpipeline vor, um das raumzeitliche Verhalten einzelner Zellen unter Verwendung eines Modells der Zellpolarität zu automatisieren und zu quantifizieren: Wachstum der Pollenröhren/Wurzelhaare und zytosolische Ionendynamik. Es wurde ein dreistufiger Algorithmus entwickelt, um ratiometrische Bilder zu verarbeiten und eine quantitative Darstellung der intrazellulären Dynamik und des Wachstums zu extrahieren. Der erste Schritt segmentiert die Zelle vom Hintergrund und erzeugt eine binäre Maske durch eine Schwellwerttechnik im Pixelintensitätsraum. Im zweiten Schritt wird ein Weg durch die Mittellinie der Zelle durch eine Skelettierungsoperation nachgezeichnet. Der dritte Schritt schließlich liefert die verarbeiteten Daten als ratiometrischen Zeitraffer und ergibt einen ratiometrischen Kymographen (d.h. ein räumliches 1D-Profil über die Zeit). Daten aus ratiometrischen Bildern, die mit genetisch kodierten fluoreszierenden Reportern aus wachsenden Pollenschläuchen aufgenommen wurden, wurden verwendet, um die Methode zu vergleichen. Diese Pipeline ermöglicht eine schnellere, weniger verzerrte und genauere Darstellung der raumzeitlichen Dynamik entlang der Mittellinie polarisierter Zellen und erweitert so das quantitative Instrumentarium, das zur Untersuchung der Zellpolarität zur Verfügung steht. Der AMEBaS-Python-Quellcode ist verfügbar unter: https://github.com/badain/amebas.git
Introduction
Die Zellpolarität ist ein grundlegender biologischer Prozess, bei dem die konzertierte Wirkung einer Ansammlung von räumlich konzentrierten Molekülen und Strukturen in der Etablierung spezialisierter morphologischer subzellulärer Domänen gipfelt1. Zellteilung, Wachstum und Migration hängen von solchen Polaritätsstellen ab, während ihr Verlust mit Krebs bei epithelialen Gewebeerkrankungen in Verbindung gebracht wurde2.
Apikal wachsende Zellen sind ein dramatisches Beispiel für Polarität, bei der sich die Polaritätsstelle an der Spitze typischerweise auf extrazelluläre Signale umorientiert3. Dazu gehören die Entwicklung von Neuriten, Pilzhyphen, Wurzelhaaren und Pollenschläuchen, bei denen mehrere zelluläre Prozesse ausgeprägte Unterschiede von der Zellspitze zum Schaft hin zeigen. Insbesondere in Pollenschläuchen sind die Aktinpolymerisation, der Vesikeltransport und die Ionenkonzentrationen deutlich polarisiert und zeigen spitzenfokussierte Gradienten4. Pollenschläuche sind die männlichen Gametophyten von Blütenpflanzen und sind dafür verantwortlich, die Samenzellen in die Eizelle zu bringen, indem sie ausschließlich an der Spitze der Zelle mit einer der schnellsten Wachstumsraten wachsen, die für eine einzelne Zelle bekannt sind. Die spitzenfokussierten Gradienten von Ionen wie Calcium 5 (Ca2+) und Protonen 6 (H+) spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung des Pollenschlauchwachstums, das für die Erfüllung seiner biologischen Hauptfunktion, die in einer doppelten Befruchtung gipfelt, unerlässlich ist 5,6. Daher sind quantitative Methoden zur Analyse der raumzeitlichen Dynamik entlang der Mittellinie apikal wachsender Zellen unerlässlich, um die zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen, die dem polarisierten Wachstum zugrunde liegen 7,8,9. Forscher verwenden häufig Kymographen, d. h. eine Matrix, die die Pixelintensitäten der Mittellinie der Zelle (z. B. Spalten) im Laufe der Zeit (z. B. Zeilen) darstellt und es ermöglicht, das Zellwachstum und die Zellwanderung in der Diagonalen zu visualisieren (Abbildung 1). Trotz ihrer Nützlichkeit werden Kymographen häufig durch manuelles Nachzeichnen der Mittellinie extrahiert, was anfällig für Verzerrungen und menschliche Fehler ist und gleichzeitig ziemlich mühsam ist. Dies erfordert ein automatisiertes Verfahren der Mittellinienextraktion, das das erste Merkmal der hier vorgestellten Pipeline mit dem Namen AMEBaS ist: Eineutomatische M-Idline-E-Xtraktion und eine Ba ckground-S-Traktion von ratiometrischen Fluoreszenzzeitraffern polarisierter Einzelzellen.
In Bezug auf experimentelle Verfahren kann die quantitative Abbildung von Ionen/Molekülen/Spezies von Interesse in einzelnen Zellen mit genetisch kodierten Fluoreszenzsondenerreicht werden 10. Unter den ständig wachsenden Möglichkeiten sind ratiometrische Sonden eine der genauesten, da sie unterschiedliche Fluoreszenzwellenlängen emittieren, wenn sie an die interessierenden Moleküle gebunden oder ungebunden sind11. Dies ermöglicht die Korrektur der räumlichen Heterogenität in der intrazellulären Konzentration der Sonde, indem das Verhältnis zweier Kanäle mit ihrem kanalspezifischen Hintergrund subtrahiert wird. Die Schätzung des Hintergrundschwellenwerts für jeden Kanal und jeden Zeitpunkt kann jedoch eine komplexe Aufgabe sein, da er oft räumlich aufgrund von Effekten wie Schattierungen, bei denen die Ecken des Bildes Helligkeitsschwankungen relativ zur Mitte aufweisen, und im Laufe der Zeit aufgrund des Verblassens des Fluorophors (Photobleaching)12 variiert. Obwohl es mehrere mögliche Methoden gibt, schlägt dieses Manuskript vor, die Hintergrundintensität automatisch unter Verwendung der mit dem Isodata-Algorithmus13 erhaltenen Segmentierungsschwelle zu bestimmen, die dann durch polynomiale Regression als Standard über Frames geglättet wird. Räumliche Komponenten, die sich aus der Fluoreszenzheterogenität ergeben, die nicht mit der entfernten Zielzelle inVerbindung steht, wurden bei dieser Methode jedoch ignoriert. Die automatische Schwellenwertbestimmung kann mit verschiedenen Methoden durchgeführt werden, aber der Isodata-Algorithmus lieferte empirisch die besten Ergebnisse. Daher sind die automatische Hintergrundwertsubtraktion und die ratiometrische Berechnung das zweite Hauptmerkmal von AMEBaS (Abbildung 1), das zusammengenommen einen Stapel von Zweikanal-Fluoreszenzmikroskopiebildern als Eingabe empfängt, die Mittellinie der Zelle und den kanalspezifischen Hintergrund schätzt und Kymographen beider Kanäle und ihres Verhältnisses (Hauptausgang #1) nach Hintergrundsubtraktion, Glättung und Ausreißerentfernung ausgibt. zusammen mit einem Stapel ratiometrischer Bilder (Hauptausgabe #2).
AMEBaS wurde mit Fluoreszenzzeitraffern von wachsenden Arabidopsis-Pollenröhrchen getestet, die unter einem Mikroskop aufgenommen wurden, entweder mit ratiometrischen Ca2+ (CaMeleon)8 oder pH (pHluorin)6 Sensoren, die unter dem pollenspezifischen LAT52-Promotor exprimiert wurden. Die Bilder von jedem Kanal wurden alle 4 s aufgenommen, gekoppelt mit einem inversen Mikroskop, einer frontbelichteten Kamera (2560 Pixel × 2160 Pixel, Pixelgröße 6,45 μm), einem Fluoreszenzstrahler und einem Wasserimmersionsobjektiv 63x, 1,2NA. Die für CaMeleon verwendeten Filtereinstellungen waren: Anregung 426-450 nm (CFP) und 505-515 nm (YFP), Emission 458-487 nm (CFP) und 520-550 nm (YFP), während für pHluorin Anregung 318-390 nm (DAPI) und 428-475 nm (FITC), Emission 435-448 nm (DAPI) und 523-536 nm (FITC). Ein vollständiger Datensatz wurde zum Testen bei Zenodo hinzugefügt (DOI: 10.5281/zenodo.7975350)14.
Darüber hinaus wurde die Pipeline mit Wurzelhaardaten getestet, wobei die Bildgebung mit einem Lichtblattmikroskop (SPIM) durchgeführt wurde, wie zuvor beschrieben 15,16, wobei Arabidopsis-Wurzelhaare den genetisch kodierten Ca2+ Reporter NES-YC3.6 unter der Kontrolle des UBQ10-Promotors17 exprimierten. Die selbstgebaute Software LabView, die die Kameraaufnahme, die Probenverschiebung und den Shutter des Lichtblattmikroskops steuerte, ermöglichte die Beobachtung der beiden cpVenus- und CFP-Kanäle, aber auch die Visualisierung ihres Verhältnisses in Echtzeit. Jedes Verhältnisbild des Zeitraffers stellte eine Projektion maximaler Intensität (MIP) zwischen den cpVenus- und CFP-Fluoreszenzkanälen dar, die von 15 Schichten der Probe im Abstand von 3 μm aufgenommen wurden. Das Zeitraffer-cpVenus/CFP-Verhältnis der MIPs wurde gespeichert und direkt für die AMEBaS-Analyse verwendet.
Obwohl diese Pipeline mit mehreren Arten von wachsenden und migrierenden Zellen arbeiten kann, wurde sie speziell entwickelt, um wachsende Zellen zu analysieren, die ausschließlich an der Spitze wachsen, wie z. B. Pollenschläuche, Wurzelhaare und Pilzhyphen, bei denen es eine Entsprechung der nicht wachsenden zytoplasmatischen Regionen zwischen den Frames gibt. Wenn eine solche Entsprechung nicht vorhanden ist, sollte der Benutzer die Option complete_skeletonization in Schritt 1.3.1.1 auswählen (weitere Informationen finden Sie im Abschnitt Diskussion).
Abbildung 1: Ein Überblick über den Pipeline-Workflow. Die AMEBaS-Pipeline analysiert und verarbeitet mikroskopische Zeitraffer in drei Hauptschritten: Einzelzellsegmentierung, Midline-Tracing und Kymograph-Generierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier vorgestellte neuartige Methode ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Analyse von fluoreszenzmikroskopischen Bildstapeln polarisierter Zellen zu rationalisieren und zu automatisieren. Aktuelle Methoden, die in der Literatur beschrieben werden, wie z. B. ImageJ Kymograph-Plugins, erfordern eine manuelle Verfolgung der Mittellinie der polarisierten Zelle von Interesse, eine Aufgabe, die nicht nur zeitaufwändig, sondern auch anfällig für menschliche Fehler ist. Da die Definition der Mittellinie in dieser Pip…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich für die FAPESP-Zuschüsse 2015/22308-2, 2019/23343-7, 2019/26129-6, 2020/06744-5, 2021/05363-0, CNPq, NIH R01 Grant GM131043 und die NSF-Zuschüsse MCB1714993, MCB1930165 für die finanzielle Unterstützung. Die Wurzelhaardaten wurden mit der Infrastruktur und unter der Aufsicht von Prof. Andrea Bassi und Prof. Alex Costa erstellt.
Materials
| Github | Github | https://github.com/badain/amebas | |
| Google Colab | https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb |
References
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