AMEBaS: חילוץ אוטומטי של קו אמצע וחיסור רקע של פלואורסצנטיות רציומטרית של תאים בודדים מקוטבים
Summary
השיטות הנוכחיות לניתוח הדינמיקה התוך-תאית של תאים בודדים מקוטבים הן לעתים קרובות ידניות וחסרות סטנדרטיזציה. כתב יד זה מציג צינור ניתוח תמונות חדשני לאוטומציה של חילוץ קו אמצע של תאים מקוטבים בודדים וכימות התנהגות מרחבית-זמנית ממעברי זמן בממשק מקוון ידידותי למשתמש.
Abstract
קוטביות התא היא תופעה מקרוסקופית הנוצרת על ידי אוסף של מולקולות ומבנים מרוכזים מרחבית ששיאם בהופעתם של תחומים מיוחדים ברמה התת-תאית. היא קשורה לפיתוח מבנים מורפולוגיים אסימטריים העומדים בבסיס פונקציות ביולוגיות מרכזיות כגון חלוקת תאים, גדילה והגירה. בנוסף, הפרעה בקוטביות התא נקשרה להפרעות הקשורות לרקמות כגון סרטן ודיספלסיה קיבה.
השיטות הנוכחיות להערכת הדינמיקה המרחבית-זמנית של כתבים פלואורסצנטיים בתאים מקוטבים בודדים כוללות לעתים קרובות צעדים ידניים להתחקות אחר קו אמצע לאורך הציר הראשי של התאים, דבר הגוזל זמן רב ונוטה להטיות חזקות. יתר על כן, למרות שניתוח יחסימטרי יכול לתקן את ההתפלגות הלא אחידה של מולקולות הכתב באמצעות שני ערוצים פלואורסצנטיים, טכניקות חיסור רקע הן לעתים קרובות שרירותיות וחסרות תמיכה סטטיסטית.
כתב יד זה מציג צינור חישובי חדשני לאוטומציה וכימות של ההתנהגות המרחבית-זמנית של תאים בודדים באמצעות מודל של קוטביות התא: צמיחת שיער צינור/שורש אבקה ודינמיקה של יונים ציטוסוליים. אלגוריתם בן שלושה שלבים פותח כדי לעבד תמונות יחסיות ולחלץ ייצוג כמותי של דינמיקה תוך תאית וצמיחה. השלב הראשון מפלח את התא מהרקע, ומפיק מסיכה בינארית באמצעות טכניקת סף במרחב עוצמת הפיקסלים. השלב השני עוקב אחר נתיב דרך קו האמצע של התא באמצעות פעולת שלד. לבסוף, השלב השלישי מספק את הנתונים המעובדים כקיטוע זמן יחסימטרי ומניב קימוגרף יחסימטרי (כלומר, פרופיל מרחבי 1D לאורך זמן). נתונים מתמונות יחסיות שנרכשו עם כתבים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית מגידולי אבקה שימשו כדי לבחון את השיטה. צינור זה מאפשר ייצוג מהיר, מוטה פחות ומדויק יותר של הדינמיקה המרחבית-טמפורלית לאורך קו האמצע של תאים מקוטבים, ובכך מקדם את ערכת הכלים הכמותית הזמינה לחקר קוטביות התא. קוד המקור של AMEBaS Python זמין בכתובת: https://github.com/badain/amebas.git
Introduction
קוטביות התא היא תהליך ביולוגי בסיסי שבו הפעולה המרוכזת של אוסף של מולקולות ומבנים מרוכזים מרחבית מגיעה לשיאה בהקמת תחומים תת-תאיים מורפולוגיים מיוחדים1. חלוקת תאים, גדילה ונדידה מסתמכים על אתרי קוטביות כאלה, בעוד שאובדנו נקשר לסרטן בהפרעות הקשורות לרקמת אפיתל2.
תאים הגדלים באופן אפי הם דוגמה דרמטית לקוטביות, שבה אתר הקוטביות בקצה בדרך כלל מכוון מחדש לרמזים חוץ-תאיים3. אלה כוללים נוירוטים מתפתחים, קורים פטרייתיים, שערות שורש וצינורות אבקה, שבהם תהליכים תאיים מרובים מראים הבדלים בולטים מקצה התא לכיוון השוק. בצינורות אבקה, במיוחד, פילמור אקטין (actin polymerization), סחר בשלפוחיות וריכוזים יוניים מקוטבים במידה ניכרת, ומראים שיפועים ממוקדי קצה4. צינורות אבקה הם הגמטופיטים הזכריים של צמחים פורחים והם אחראים על העברת תאי הזרע לביצית על ידי גידול בלעדי בקודקוד התא באחד מקצבי הצמיחה המהירים ביותר הידועים לתא בודד. השיפועים הממוקדים בקצה של יונים כגון סידן 5 (Ca2+) ופרוטונים 6 (H+) ממלאים תפקיד מרכזי בשמירה על צמיחת צינור האבקה, שהוא חיוני להשגת תפקידה הביולוגי העיקרי שמגיע לשיאו בהפריה כפולה 5,6. לפיכך, שיטות כמותיות לניתוח הדינמיקה המרחבית-טמפורלית לאורך קו האמצע של תאים הגדלים באופן אפי חיוניות לחקר המנגנונים התאיים והמולקולריים העומדים בבסיס צמיחה מקוטבת 7,8,9. חוקרים משתמשים לעתים קרובות בקימוגרפים, כלומר מטריצה שמייצגת את עוצמות הפיקסלים של קו האמצע של התא (למשל, עמודות) לאורך זמן (למשל, שורות), מה שמאפשר להמחיש צמיחה ונדידה של תאים באלכסון (איור 1). למרות התועלת שלהם, קימוגרפים מופקים לעתים קרובות על ידי מעקב ידני אחר קו האמצע, להיות נוטה הטיות וטעויות אנוש תוך גם להיות מייגע למדי. זה דורש שיטה אוטומטית של חילוץ קו אמצע שהיא התכונה הראשונה של הצינור שהוצג כאן בשם AMEBaS:מתיחה אוטומטית Midline Eו- Background Subtraction של מעברי זמן פלואורסצנטיים יחסיים של תאים בודדים מקוטבים.
במונחים של הליכים ניסיוניים, הדמיה כמותית של יונים/מולקולות/מינים בעלי עניין בתאים בודדים יכולה להיות מושגת באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות מקודדות גנטית10. מבין האפשרויות המתרחבות ללא הרף, גשושיות יחסיות הן אחת המדויקות ביותר מכיוון שהן פולטות אורכי גל פלואורסצנטיים שונים כאשר הן קשורות/לא קשורות למולקולות המעניינות11. זה מאפשר תיקון של ההטרוגניות המרחבית בריכוז התוך תאי של הגשושית על ידי שימוש ביחס של שני ערוצים עם רקע ספציפי לערוץ שלהם מופחת. עם זאת, הערכת סף הרקע עבור כל ערוץ ונקודת זמן יכולה להיות משימה מורכבת, שכן לעתים קרובות היא משתנה במרחב עקב אפקטים כמו הצללה, כאשר פינות התמונה יש שונות בהירות ביחס למרכז, ועם הזמן עקב דהיית הפלואורופור (photobleaching)12. למרות שישנן מספר שיטות אפשריות, כתב יד זה מציע לקבוע את עוצמת הרקע באופן אוטומטי באמצעות סף הסגמנטציה המתקבל עם אלגוריתם איזודאטה13, אשר לאחר מכן מוחלק על פני מסגרות באמצעות רגרסיה פולינומית כסטנדרט. עם זאת, רכיבים מרחביים הנובעים מהטרוגניות פלואורסצנטית שאינה קשורה לתא המטרה שהוסרוב-12, זכו להתעלמות בשיטה זו. סף אוטומטי יכול להתבצע במספר שיטות, אך אלגוריתם איזודאטה הפיק את התוצאות הטובות ביותר מבחינה אמפירית. לפיכך, חיסור אוטומטי של ערך רקע וחישוב יחסימטרי הם התכונה העיקרית השנייה של AMEBaS (איור 1), אשר, ביחד, מקבלת כקלט ערימה של תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי דו-ערוצי, מעריכה את קו האמצע של התא ואת הרקע הספציפי לערוץ, ומפיקה קימוגרפיות של שני הערוצים והיחס ביניהם (פלט ראשי #1) לאחר חיסור רקע, החלקה והסרה חריגה, יחד עם ערימה של תמונות יחסיות (פלט ראשי #2).
AMEBaS נבדק עם הפסקות זמן פלואורסצנטיות של גידולי אבקה Arabidopsis שהתקבלו תחת מיקרוסקופ, או עם Ca2+ (CaMeleon)8 או pH (pHluorin)6 חיישנים ratiometric מבוטא תחת מקדם LAT52 ספציפי אבקה. תמונות מכל ערוץ צולמו כל 4 שניות כשהוא מחובר למיקרוסקופ הפוך, מצלמה מוארת קדמית (2560 פיקסלים × 2160 פיקסלים, גודל פיקסל 6.45 מיקרומטר), תאורת פלואורסצנטיות ועדשת מטרה טבילת מים 63x, 1.2NA. הגדרות המסננים ששימשו עבור CaMeleon היו: עירור 426-450 ננומטר (CFP) ו- 505-515 ננומטר (YFP), פליטה 458-487 ננומטר (CFP) ו- 520-550 ננומטר (YFP), ואילו עבור pHluorin, עירור 318-390 ננומטר (DAPI) ו- 428-475 ננומטר (FITC), פליטה 435-448 ננומטר (DAPI) ו- 523-536 ננומטר (FITC). ערכת נתונים מלאה נוספה לבדיקה ב-Zenodo (DOI: 10.5281/zenodo.7975350)14.
בנוסף, הצינור נבדק עם נתוני שיער שורש, כאשר ההדמיה בוצעה במיקרוסקופ יריעה קלה (SPIM) כפי שתואר קודם לכן 15,16 עם שערות שורש Arabidopsis המבטאות את כתב Ca2+ המקודד גנטית NES-YC3.6 תחת שליטתו של מקדם UBQ10 17. תוכנת LabView הביתית ששלטה ברכישת המצלמה, תרגום הדגימות והצמצם של מיקרוסקופ יריעת האור אפשרה תצפית על שני ערוצי cpVenus ו-CFP, אך גם הדמיה של היחס ביניהם בזמן אמת. כל תמונת יחס של קיטוע הזמן ייצגה הקרנה בעוצמה מרבית (MIP) בין תמונות התעלות הפלואורסצנטיות cpVenus ו-CFP שהתקבלו מ-15 פרוסות של הדגימה במרווחים של 3 מיקרומטר זו מזו. יחס cpVenus/CFP בהילוך מהיר של MIPs נשמר ושימש ישירות לניתוח AMEBaS.
אף על פי שצינור זה יכול לעבוד עם סוגים רבים של תאים גדלים ונודדים, הוא תוכנן במיוחד לנתח תאים גדלים הגדלים אך ורק בקצה, כגון צינורות אבקה, שערות שורש וקורי פטריות, שבהם יש התאמה של האזורים הציטופלזמיים שאינם גדלים בין המסגרות. כאשר התכתבות כזו אינה קיימת, על המשתמש לבחור באפשרות complete_skeletonization בשלב 1.3.1.1 (עיין בסעיף דיון לקבלת פרטים נוספים).
איור 1: מבט כולל על זרימת העבודה של קו הצינור. צנרת AMEBaS מנתחת ומעבדת מעברי זמן מיקרוסקופיים בשלושה שלבים עיקריים: סגמנטציה של תא יחיד, מעקב אחר קו אמצע ויצירת קימוגרף. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה החדשנית המוצגת כאן היא כלי רב עוצמה לייעול ואוטומציה של ניתוח ערימות תמונה במיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאים מקוטבים. השיטות הנוכחיות המתוארות בספרות, כגון תוספי קימוגרף של ImageJ, דורשות מעקב ידני אחר קו האמצע של התא המקוטב המעניין, משימה שהיא לא רק גוזלת זמן אלא גם מועדת לטעויות אנוש. מכ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים אסירי תודה למענקי FAPESP 2015/22308-2, 2019/23343-7, 2019/26129-6, 2020/06744-5, 2021/05363-0, CNPq, GM131043 המענקים של NIH R01 ומענקי NSF MCB1714993, MCB1930165 לתמיכה כספית. נתוני שיער השורש הופקו עם התשתית ובהנחייתם של פרופ’ אנדריאה באסי ופרופ’ אלכס קוסטה.
Materials
| Github | Github | https://github.com/badain/amebas | |
| Google Colab | https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb |
References
- Drubin, D. G., Nelson, W. J. Origins of cell polarity. Cell. 84 (3), 335-344 (1996).
- Wodarz, A., Näthke, I. Cell polarity in development and cancer. Nature Cell Biology. 9 (9), 1016-1024 (2007).
- Palanivelu, R., Preuss, D. Pollen tube targeting and axon guidance: parallels in tip growth mechanisms. Trends in Cell Biology. 10 (12), 517-524 (2000).
- Portes, M. T., et al. . The Pollen Tube Oscillator: Integrating Biophysics and Biochemistry into Cellular Growth and Morphogenesis. Rhythms in Plants: Dynamic Responses in a Dynamic Environment. , (2015).
- Wudick, M. M., et al. CORNICHON sorting and regulation of GLR channels underlie pollen tube Ca2+ homeostasis. Science. 360 (6388), 533-536 (2018).
- Hoffmann, R. D., et al. Plasma membrane H+-ATPases sustain pollen tube growth and fertilization. Nature Communications. 11 (1), 1-15 (2020).
- Michard, E., et al. Glutamate receptor-like genes form Ca2+ channels in pollen tubes and are regulated by pistil D-serine. Science. 332 (6028), 434-437 (2011).
- Damineli, D. S., Portes, M. T., Feijó, J. A. Oscillatory signatures underlie growth regimes in Arabidopsis pollen tubes: computational methods to estimate tip location, periodicity, and synchronization in growing cells. Journal of Experimental Botany. 68 (12), 3267-3281 (2017).
- Li, K., et al. An optimized genetically encoded dual reporter for simultaneous ratio imaging of Ca2+ and H+ reveals new insights into ion signaling in plants. New Phytologist. 230 (6), 2292-2310 (2021).
- Sadoine, M., et al. Designs, applications, and limitations of genetically encoded fluorescent sensors to explore plant biology. Plant Physiology. 187 (2), 485-503 (2021).
- Grenzi, M., et al. Illuminating the hidden world of calcium ions in plants with a universe of indicators. Plant Physiology. 187 (2), 550-571 (2021).
- Munglani, G., Vogler, H., Grossniklaus, U. Fast and flexible processing of large FRET image stacks using the FRET-IBRA toolkit. PLoS Computational Biology. 18 (4), 1009242 (2022).
- Ridler, T., Calvard, S. Picture thresholding using an iterative selection method. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 8 (8), 630-632 (1978).
- Portes, M. T., Feijó, J. . Growing Arabidopsis pollen tubes expressing genetically encoded reporters for calcium and pH. , (2023).
- Candeo, A., Doccula, F. G., Valentini, G., Bassi, A., Costa, A. Light sheet fluorescence microscopy quantifies calcium oscillations in root hairs of Arabidopsis thaliana. Plant & Cell Physiology. 58 (7), 1161-1172 (2017).
- Romano Armada, N., et al. In vivo light sheet fluorescence microscopy of calcium oscillations in Arabidopsis thaliana. Methods in Molecular Biology. 1925, 87-101 (2019).
- Krebs, M., et al. FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca2+ dynamics. The Plant Journal. 69 (1), 181-192 (2012).
- Lee, T. -. C., Kashyap, R. L., Chu, C. -. N. Building skeleton models via 3-D medial surface axis thinning algorithms. CVGIP: Graphical Models and Image Processing. 56 (6), 462-478 (1994).
- Nunez-Iglesias, J., Blanch, A. J., Looker, O., Dixon, M. W., Tilley, L. A new Python library to analyse skeleton images confirms malaria parasite remodelling of the red blood cell membrane skeleton. PeerJ. 6, 4312 (2018).
