AMEBaS:分極単一細胞のレシオメトリック蛍光タイムラプスの自動正中線抽出とバックグラウンドサブトラクション

細胞極性は、空間的に集中した分子と構造の集合体の協調的な作用が、特殊な形態学的細胞内ドメインの確立で最高潮に達する基本的な生物学的プロセスです¹。細胞分裂、増殖、遊走はこのような極性部位に依存していますが、その喪失は上皮組織関連疾患の癌と関連しています²。

頂端に増殖する細胞は極性の劇的な例であり、先端の極性部位は通常、細胞外の手がかりに再配向^する3。これらには、神経突起、真菌菌糸、根毛、花粉管の発達が含まれ、複数の細胞プロセスが細胞の先端からすねに向かって顕著な違いを示します。特に花粉管では、アクチン重合、小胞輸送、イオン濃度が著しく分極し、先端に焦点を絞った勾配^{を示す4。}花粉管は顕花植物の雄性配偶体であり、単一細胞で知られている最速の成長率の1つで細胞の頂点でのみ成長することにより、精子細胞を胚珠に送達する役割を担っています。カルシウム⁵(^Ca2+)やプロトン⁶(H⁺)などのイオンの先端に焦点を絞った勾配は、花粉管の成長を維持する上で主要な役割を果たし、二重受精で最高潮に達する主要な生物学的機能を達成するために不可欠です^5,6。したがって、頂端増殖細胞の正中線に沿った時空間動態を定量的に解析する手法は、分極増殖の根底にある細胞および分子メカニズムを調査するために不可欠です^7,8,9。研究者は、細胞の正中線(列など)のピクセル強度を経時的(行など)で表すマトリックスであるキモグラフを使用することが多く、対角線上の細胞の成長と移動を視覚化できます(図1)。キモグラフは、その有用性にもかかわらず、正中線を手作業でトレースして抽出されることが多く、バイアスや人為的ミスが発生しやすく、かなり手間がかかります。これは、AMEBaSと名付けられた本明細書で紹介するパイプラインの最初の特徴である正中線抽出の自動化された方法を必要とします:偏光された単一細胞のレシオメトリック蛍光タイムラプスのユートマティックMidline EエクストラクションおよびBackground Sウブトラクション。

実験手順に関しては、単一細胞における目的のイオン/分子/種の定量的イメージングは、遺伝的にコードされた蛍光プローブ¹⁰を用いて達成することができる。拡大し続ける選択肢の中で、レシオメトリックプローブは、目的の分子に結合/非結合するときに異なる蛍光波長を発するため、最も正確なプローブの1つです¹¹。これにより、2つのチャンネルの比からチャンネル特異的なバックグラウンドを差し引いた値を使用することで、プローブの細胞内濃度の空間的不均一性を補正することができます。しかし、各チャンネルや時点の背景閾値を推定することは、画像の隅が中心に対して光度が変動するシェーディングなどの効果や、蛍光色素の退色(光退色)による時間的に変化することが多いため、複雑な作業になる可能性があります¹²。複数の方法が考えられるが、本稿では、Isodataアルゴリズム¹³で得られたセグメンテーション閾値を用いてバックグラウンド強度を自動的に決定し、これを標準として多項式回帰によってフレーム間で平滑化することを提案している。しかし、¹²で除去した標的細胞とは無関係な蛍光の不均一性に由来する空間成分は、この方法では無視された。自動閾値はいくつかの方法で実行できますが、Isodataアルゴリズムは経験的に最良の結果を生み出しました。したがって、自動バックグラウンド値減算とレシオメトリック計算は、AMEBaS(図1)の2番目の主な機能であり、これらをまとめると、デュアルチャンネル蛍光顕微鏡画像のスタックを入力として受け取り、細胞の正中線とチャンネル固有のバックグラウンドを推定し、バックグラウンド減算、平滑化、および外れ値除去後に両方のチャンネルとその比率(メイン出力#1)のキモグラフを出力します。 レシオメトリック画像のスタック(メイン出力#2)と一緒に。

AMEBaSは、花粉特異的LAT52プロモーター下で発現したCa²⁺ (CaMeleon)⁸ またはpH(pH)⁶ レシオメトリックセンサーを用いて、顕微鏡下で得られた成長中のシロイヌナズナ花粉管の蛍光タイムラプスで試験されました。倒立顕微鏡、表面照射型カメラ(2560画素×2160画素、画素サイズ6.45μm)、蛍光イルミネーター、水浸対物レンズ63倍、1.2NAを組み合わせて、各チャンネルの画像を4秒ごとに撮影した。CaMeleonのフィルター設定は、励起426-450 nm(CFP)および505-515 nm(YFP)、発光458-487 nm(CFP)および520-550 nm(YFP)であり、pHluorinでは励起318-390 nm(DAPI)および428-475 nm(FITC)、発光435-448 nm(DAPI)および523-536 nm(FITC)であった。Zenodoでテストするための完全なデータセットが追加されました(DOI:10.5281/zenodo.7975350)¹⁴。

さらに、パイプラインは、UBQ10プロ^{モーター17}の制御下で遺伝的にコードされた^Ca2+レポーターNES-YC3.6を発現するシロイヌナズナの根毛を用いて、前述のようにライトシート顕微鏡(SPIM)でイメージングを行った^15,16。ライトシート顕微鏡のカメラ取得、サンプル変換、シャッターを制御する自作のLabViewソフトウェアにより、2つのcpVenusチャンネルとCFPチャンネルの観察だけでなく、それらの比率をリアルタイムで視覚化することもできました。タイムラプスの各比率画像は、3 μm間隔のサンプルの15スライスから得られたcpVenus蛍光チャンネル画像とCFP蛍光チャンネル画像の間の最大強度投影(MIP)を表しています。MIPのタイムラプスcpVenus/CFP比を保存し、AMEBaS解析に直接使用しました。

このパイプラインは、複数の種類の増殖細胞と遊走細胞を扱うことができますが、花粉管、根毛、真菌菌糸など、フレーム間に成長しない細胞質領域が対応している先端のみで成長する成長細胞を分析するために特別に設計されました。このような対応が存在しない場合、ユーザーはステップ 1.3.1.1 で complete_skeletonization オプションを選択する必要があります (詳細については、「ディスカッション」セクションを参照してください)。

図 1: パイプライン ワークフローの概要。 AMEBaSパイプラインは、シングルセルセグメンテーション、ミッドライントレーシング、キモグラフ生成の3つの主要なステップで、顕微鏡のタイムラプスを解析および処理します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。