AMEBaS: استخراج خط الوسط التلقائي وطرح الخلفية للفواصل الزمنية الفلورية النسبية للخلايا المفردة المستقطبة
Summary
غالبا ما تكون الطرق الحالية لتحليل الديناميات داخل الخلايا للخلايا المفردة المستقطبة يدوية وتفتقر إلى التوحيد القياسي. تقدم هذه المخطوطة خط أنابيب جديدا لتحليل الصور لأتمتة استخراج خط الوسط للخلايا المستقطبة المفردة وتحديد السلوك الزماني المكاني من الفترات الزمنية في واجهة سهلة الاستخدام عبر الإنترنت.
Abstract
قطبية الخلية هي ظاهرة عيانية أنشأتها مجموعة من الجزيئات والهياكل المركزة مكانيا والتي بلغت ذروتها في ظهور مجالات متخصصة على المستوى دون الخلوي. يرتبط بتطوير الهياكل المورفولوجية غير المتماثلة التي تكمن وراء الوظائف البيولوجية الرئيسية مثل انقسام الخلايا والنمو والهجرة. بالإضافة إلى ذلك ، تم ربط اضطراب قطبية الخلية بالاضطرابات المرتبطة بالأنسجة مثل السرطان وخلل التنسج المعدي.
غالبا ما تتضمن الطرق الحالية لتقييم الديناميات الزمانية المكانية لمراسلي الفلورسنت في الخلايا المستقطبة الفردية خطوات يدوية لتتبع خط الوسط على طول المحور الرئيسي للخلايا ، والذي يستغرق وقتا طويلا وعرضة للتحيزات القوية. علاوة على ذلك ، على الرغم من أن التحليل النسبي يمكن أن يصحح التوزيع غير المتكافئ لجزيئات المراسل باستخدام قناتين مضان ، إلا أن تقنيات الطرح الخلفية غالبا ما تكون تعسفية وتفتقر إلى الدعم الإحصائي.
تقدم هذه المخطوطة خط أنابيب حسابي جديد لأتمتة وقياس السلوك الزماني المكاني للخلايا المفردة باستخدام نموذج لقطبية الخلية: أنبوب حبوب اللقاح / نمو شعر الجذر وديناميكيات الأيونات الخلوية. تم تطوير خوارزمية من ثلاث خطوات لمعالجة الصور التناسبية واستخراج تمثيل كمي للديناميكيات داخل الخلايا والنمو. تقوم الخطوة الأولى بتقسيم الخلية من الخلفية ، مما ينتج قناعا ثنائيا من خلال تقنية الحد الأدنى في مساحة كثافة البكسل. الخطوة الثانية تتبع مسارا عبر خط الوسط للخلية من خلال عملية الهيكل العظمي. أخيرا ، توفر الخطوة الثالثة البيانات المعالجة كفاصل زمني نسبي وتنتج كيموغراف نسبي (أي ملف تعريف مكاني 1D عبر الزمن). تم استخدام البيانات من الصور النسبية التي تم الحصول عليها باستخدام مراسلي الفلورسنت المشفرة وراثيا من أنابيب حبوب اللقاح المتنامية لقياس الطريقة. يسمح خط الأنابيب هذا بتمثيل أسرع وأقل تحيزا وأكثر دقة للديناميكيات الزمانية المكانية على طول خط الوسط للخلايا المستقطبة ، وبالتالي تطوير مجموعة الأدوات الكمية المتاحة للتحقيق في قطبية الخلية. الكود المصدري AMEBaS Python متاح على: https://github.com/badain/amebas.git
Introduction
قطبية الخلية هي عملية بيولوجية أساسية يتوج فيها العمل المتضافر لمجموعة من الجزيئات والهياكل المركزة مكانيا بإنشاء مجالات تحت خلوية مورفولوجية متخصصة1. يعتمد انقسام الخلايا ونموها وهجرتها على مواقع القطبية هذه ، في حين ارتبط فقدانها بالسرطان في الاضطرابات المرتبطة بالأنسجة الظهارية2.
تعد الخلايا النامية قميا مثالا مثيرا على القطبية ، حيث يقوم موقع القطبية عند الطرف عادة بإعادة التوجيه إلى إشارات خارج الخلية3. وتشمل هذه الخلايا العصبية النامية ، والخيوط الفطرية ، وشعيرات الجذر ، وأنابيب حبوب اللقاح ، حيث تظهر العمليات الخلوية المتعددة اختلافات واضحة من طرف الخلية نحو الساق. في أنابيب حبوب اللقاح ، على وجه الخصوص ، يتم استقطاب بلمرة الأكتين ، والاتجار بالحويصلة ، والتركيزات الأيونية بشكل ملحوظ ، مما يدل على التدرجات التي تركز على الطرف4. أنابيب حبوب اللقاح هي النباتات المشيجية الذكرية للنباتات المزهرة، وهي مسئولة عن توصيل المنوية إلى البويضة عن طريق النمو حصريا في قمة الخلية بأحد أسرع معدلات النمو المعروفة للخلية الواحدة. تلعب التدرجات التي تركز على الأطراف للأيونات مثل الكالسيوم 5 (Ca2+) والبروتونات 6 (H +) دورا رئيسيا في الحفاظ على نمو أنبوب حبوب اللقاح ، وهو أمر ضروري لإنجاز وظيفته البيولوجية الرئيسية التي تبلغ ذروتها في الإخصاب المزدوج 5,6. وبالتالي ، فإن الطرق الكمية لتحليل الديناميات الزمانية المكانية على طول خط الوسط للخلايا النامية قميا ضرورية للتحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء النمو المستقطب7،8،9. غالبا ما يستخدم الباحثون أجهزة القياس الكمي ، أي مصفوفة تمثل كثافة البكسل لخط وسط الخلية (على سبيل المثال ، الأعمدة) عبر الوقت (على سبيل المثال ، الصفوف) ، مما يسمح بتصور نمو الخلية وهجرتها في القطر (الشكل 1). على الرغم من فائدتها ، يتم استخراج أجهزة التصوير المكي في كثير من الأحيان عن طريق تتبع خط الوسط يدويا ، كونها عرضة للتحيزات والأخطاء البشرية بينما تكون أيضا شاقة إلى حد ما. وهذا يستدعي طريقة آلية لاستخراج خط الوسط وهي الميزة الأولى لخط الأنابيب الذي تم تقديمه هنا باسم AMEBaS: سحب Utomatic Midline Extraction و Background Sللفترات الزمنية الفلورية النسبية للخلايا المفردة المستقطبة.
من حيث الإجراءات التجريبية ، يمكن تحقيق التصوير الكمي للأيونات / الجزيئات / الأنواع ذات الأهمية في الخلايا المفردة باستخدام مجسات الفلورسنت المشفرة وراثيا10. من بين الخيارات الآخذة في التوسع باستمرار ، تعد مجسات القياس النسبي واحدة من أكثر الخيارات دقة لأنها تنبعث منها أطوال موجية مضان مختلفة عندما تكون مرتبطة / غير مرتبطة بالجزيئات محل الاهتمام11. وهذا يسمح بتصحيح عدم التجانس المكاني في التركيز داخل الخلايا للمسبار باستخدام نسبة قناتين مع طرح خلفية محددة بقناتهما. ومع ذلك ، يمكن أن يكون تقدير عتبة الخلفية لكل قناة ونقطة زمنية مهمة معقدة لأنها غالبا ما تختلف في المساحة بسبب تأثيرات مثل التظليل ، حيث يكون لزوايا الصورة تباين في اللمعان بالنسبة للمركز ، وفي الوقت المناسب بسبب تلاشي الفلوروفور (التبييض الضوئي)12. على الرغم من وجود العديد من الطرق الممكنة ، تقترح هذه المخطوطة تحديد كثافة الخلفية تلقائيا باستخدام عتبة التجزئة التي تم الحصول عليها باستخدام خوارزمية Isodata13 ، والتي يتم بعد ذلك تنعيمها عبر الإطارات من خلال الانحدار متعدد الحدود كمعيار. ومع ذلك ، تم تجاهل المكونات المكانية الناتجة عن عدم التجانس الفلوري غير المرتبط بالخلية المستهدفة التي تمت إزالتها في12 ، بهذه الطريقة. يمكن إجراء العتبة التلقائية بعدة طرق ، لكن خوارزمية Isodata أنتجت أفضل النتائج تجريبيا. وبالتالي ، فإن الطرح التلقائي لقيمة الخلفية وحساب قياس النسبة هما السمة الرئيسية الثانية ل AMEBaS (الشكل 1) ، والتي ، مجتمعة ، تتلقى كمدخلات كومة من صور المجهر الفلوري ثنائي القناة ، وتقدر خط الوسط للخلية والخلفية الخاصة بالقناة ، وتخرج kymographs لكلتا القناتين ونسبتهما (الإخراج الرئيسي #1) بعد طرح الخلفية ، والتنعيم ، وإزالة القيم الخارجية ، جنبا إلى جنب مع كومة من الصور ratiometric (الإخراج الرئيسي # 2).
تم اختبار AMEBaS باستخدام الفترات الزمنية الفلورية لأنابيب حبوب لقاح Arabidopsis المتنامية التي تم الحصول عليها تحت المجهر ، إما باستخدام مستشعرات Ca2+ (CaMeleon) 8 أو الأس الهيدروجيني (pHluorin) 6 المعبر عنها تحت محفز LAT52 الخاص بحبوب اللقاح. تم التقاط الصور من كل قناة كل 4 ثوان مقترنة بمجهر مقلوب ، وكاميرا بإضاءة أمامية (2560 بكسل × 2160 بكسل ، وحجم بكسل 6.45 ميكرومتر) ، وإضاءة مضان ، وعدسة موضوعية للغمر المائي 63x ، 1.2NA. كانت إعدادات المرشحات المستخدمة ل CaMeleon هي: الإثارة 426-450 نانومتر (CFP) و 505-515 نانومتر (YFP) ، والانبعاثات 458-487 نانومتر (CFP) و 520-550 نانومتر (YFP) ، بينما بالنسبة ل pHluorin ، الإثارة 318-390 نانومتر (DAPI) و 428-475 نانومتر (FITC) ، الانبعاث 435-448 نانومتر (DAPI) و 523-536 نانومتر (FITC). تمت إضافة مجموعة بيانات كاملة للاختبار في Zenodo (DOI: 10.5281 / zenodo.7975350) 14.
بالإضافة إلى ذلك ، تم اختبار خط الأنابيب باستخدام بيانات شعر الجذر ، حيث تم إجراء التصوير باستخدام مجهر ورقة ضوئية (SPIM) كما هو موضح سابقا15,16 مع شعيرات جذر Arabidopsis التي تعبر عن مراسل Ca2+ المشفر وراثيا NES-YC3.6 تحت سيطرة مروج UBQ10 17. سمح برنامج LabView محلي الصنع الذي يتحكم في الحصول على الكاميرا وترجمة العينات ومصراع مجهر ورقة الضوء بمراقبة قناتي cpVenus و CFP ، ولكن أيضا تصور نسبتهما في الوقت الفعلي. تمثل كل صورة نسبة للفاصل الزمني إسقاطا أقصى كثافة (MIP) بين صور قنوات الفلورسنت cpVenus و CFP التي تم الحصول عليها من 15 شريحة من العينة متباعدة بمقدار 3 ميكرومتر. تم حفظ نسبة cpVenus / CFP ذات الفاصل الزمني ل MIPs واستخدامها مباشرة لتحليل AMEBaS.
على الرغم من أن خط الأنابيب هذا يمكن أن يعمل مع أنواع متعددة من الخلايا النامية والمهاجرة ، فقد تم تصميمه خصيصا لتحليل الخلايا النامية التي تنمو حصريا عند الطرف ، مثل أنابيب حبوب اللقاح ، والشعيرات الجذرية ، والخيوط الفطرية ، حيث يوجد تطابق للمناطق السيتوبلازمية غير النامية بين الإطارات. في حالة عدم وجود مثل هذه المراسلات ، يجب على المستخدم اختيار خيار complete_skeletonization في الخطوة 1.3.1.1 (انظر قسم المناقشة لمزيد من التفاصيل).
الشكل 1: نظرة عامة على سير عمل خط الأنابيب. يحلل خط أنابيب AMEBaS ويعالج الفترات الزمنية المجهرية في ثلاث خطوات رئيسية: تجزئة الخلية الواحدة ، وتتبع خط الوسط ، وتوليد الكيموغراف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطريقة الجديدة المعروضة هنا هي أداة قوية لتبسيط وأتمتة تحليل مكدسات الصور المجهرية الفلورية للخلايا المستقطبة. تتطلب الطرق الحالية الموضحة في الأدبيات ، مثل المكونات الإضافية ImageJ Kymograph ، تتبعا يدويا لخط الوسط للخلية المستقطبة محل الاهتمام ، وهي مهمة لا تستغرق وقتا طويلا فحسب ، بل إنها أ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يعرب المؤلفون عن امتنانهم لمنح FAPESP 2015/22308-2 و 2019/23343-7 و 2019/26129-6 و 2020/06744-5 و 2021/05363-0 و CNPq و NIH R01 Grant GM131043 ومنح NSF MCB1714993 MCB1930165 للدعم المالي. تم إنتاج بيانات الشعر الجذري باستخدام البنية التحتية وتحت إشراف البروفيسور أندريا باسي والبروفيسور أليكس كوستا.
Materials
| Github | Github | https://github.com/badain/amebas | |
| Google Colab | https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb |
References
- Drubin, D. G., Nelson, W. J. Origins of cell polarity. Cell. 84 (3), 335-344 (1996).
- Wodarz, A., Näthke, I. Cell polarity in development and cancer. Nature Cell Biology. 9 (9), 1016-1024 (2007).
- Palanivelu, R., Preuss, D. Pollen tube targeting and axon guidance: parallels in tip growth mechanisms. Trends in Cell Biology. 10 (12), 517-524 (2000).
- Portes, M. T., et al. . The Pollen Tube Oscillator: Integrating Biophysics and Biochemistry into Cellular Growth and Morphogenesis. Rhythms in Plants: Dynamic Responses in a Dynamic Environment. , (2015).
- Wudick, M. M., et al. CORNICHON sorting and regulation of GLR channels underlie pollen tube Ca2+ homeostasis. Science. 360 (6388), 533-536 (2018).
- Hoffmann, R. D., et al. Plasma membrane H+-ATPases sustain pollen tube growth and fertilization. Nature Communications. 11 (1), 1-15 (2020).
- Michard, E., et al. Glutamate receptor-like genes form Ca2+ channels in pollen tubes and are regulated by pistil D-serine. Science. 332 (6028), 434-437 (2011).
- Damineli, D. S., Portes, M. T., Feijó, J. A. Oscillatory signatures underlie growth regimes in Arabidopsis pollen tubes: computational methods to estimate tip location, periodicity, and synchronization in growing cells. Journal of Experimental Botany. 68 (12), 3267-3281 (2017).
- Li, K., et al. An optimized genetically encoded dual reporter for simultaneous ratio imaging of Ca2+ and H+ reveals new insights into ion signaling in plants. New Phytologist. 230 (6), 2292-2310 (2021).
- Sadoine, M., et al. Designs, applications, and limitations of genetically encoded fluorescent sensors to explore plant biology. Plant Physiology. 187 (2), 485-503 (2021).
- Grenzi, M., et al. Illuminating the hidden world of calcium ions in plants with a universe of indicators. Plant Physiology. 187 (2), 550-571 (2021).
- Munglani, G., Vogler, H., Grossniklaus, U. Fast and flexible processing of large FRET image stacks using the FRET-IBRA toolkit. PLoS Computational Biology. 18 (4), 1009242 (2022).
- Ridler, T., Calvard, S. Picture thresholding using an iterative selection method. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 8 (8), 630-632 (1978).
- Portes, M. T., Feijó, J. . Growing Arabidopsis pollen tubes expressing genetically encoded reporters for calcium and pH. , (2023).
- Candeo, A., Doccula, F. G., Valentini, G., Bassi, A., Costa, A. Light sheet fluorescence microscopy quantifies calcium oscillations in root hairs of Arabidopsis thaliana. Plant & Cell Physiology. 58 (7), 1161-1172 (2017).
- Romano Armada, N., et al. In vivo light sheet fluorescence microscopy of calcium oscillations in Arabidopsis thaliana. Methods in Molecular Biology. 1925, 87-101 (2019).
- Krebs, M., et al. FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca2+ dynamics. The Plant Journal. 69 (1), 181-192 (2012).
- Lee, T. -. C., Kashyap, R. L., Chu, C. -. N. Building skeleton models via 3-D medial surface axis thinning algorithms. CVGIP: Graphical Models and Image Processing. 56 (6), 462-478 (1994).
- Nunez-Iglesias, J., Blanch, A. J., Looker, O., Dixon, M. W., Tilley, L. A new Python library to analyse skeleton images confirms malaria parasite remodelling of the red blood cell membrane skeleton. PeerJ. 6, 4312 (2018).
