Akıllı Yüksek Verimli Antimikrobiyal Duyarlılık Testi / Faj Tarama Sistemi ve Lar Antimikrobiyal Direnç İndeksinin Uygulanması
Summary
Burada akıllı, yüksek verimli antimikrobiyal duyarlılık testi/faj tarama sisteminin prensibini, yapısını ve talimatını tanıtıyoruz. Uygulaması, örnek olarak Çin’in Shandong kentindeki kümes hayvanlarından izole edilen Salmonella kullanılarak gösterilmiştir. Lar indeksi hesaplanır ve antimikrobiyal direncin değerlendirilmesindeki önemi kapsamlı bir şekilde tartışılır.
Abstract
Dirençli bakteriler için antimikrobiyal duyarlılık testi (AST) ve faj yüksek verimli taramanın verimliliğini artırmak ve tespit maliyetini azaltmak için, 96 noktalı matris aşılayıcı, görüntü elde etme dönüştürücü ve ilgili yazılımı içeren akıllı bir yüksek verimli AST / faj tarama sistemi, AST kriterlerine ve Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü (CLSI) tarafından formüle edilen direnç kırılma noktalarına ( R ) göre geliştirilmiştir. Çin’in Shandong kentindeki kümes hayvanlarından izole edilen 1.500 Salmonella suşunun 10 antimikrobiyal ajana karşı minimum inhibitör konsantrasyon (MIC) dağılımlarının (R / 8 ila 8R) AST ve istatistikleri, akıllı yüksek verimli AST / faj tarama sistemi tarafından gerçekleştirildi. “Daha az antibiyoz, daha az direnç ve az antibiyoza kadar rezidüel” anlamına gelen Lar indeksi, her bir MK’nin ağırlıklı ortalamasının hesaplanması ve R’ye bölünmesi ile elde edildi. Bu yaklaşım, yüksek dirençli suşların antimikrobiyal direnç (AMR) derecesini karakterize etmek için direnç prevalansının kullanılmasına kıyasla doğruluğu artırır. Yüksek AMR’li Salmonella suşları için, litik fajlar bu sistem tarafından faj kütüphanesinden verimli bir şekilde tarandı ve lizis spektrumu hesaplandı ve analiz edildi. Sonuçlar, akıllı yüksek verimli AST / faj tarama sisteminin çalıştırılabilir, doğru, yüksek verimli, ucuz ve bakımı kolay olduğunu gösterdi. Shandong veteriner antimikrobiyal direnç izleme sistemi ile birlikte sistem, AMR ile ilgili bilimsel araştırma ve klinik tespit için uygundu.
Introduction
Antimikrobiyal ajanlar bakteriyel enfeksiyon hastalıklarını önlemek için yaygın olarak kullanıldığından, antimikrobiyal direnç (AMR) küresel bir halk sağlığı sorunu haline gelmiştir1. AMR ile mücadele, epidemiyolojik patojenlerin AMR’sini izlemek ve hassas antimikrobiyal ajanların ve litik bakteriyofajların sinerjik tedavisinin mevcut ana görevidir2.
İn vitro antimikrobiyal duyarlılık testi (AST), tedaviyi izlemek ve AMR seviyesini tespit etmek için temel dayanaktır. Antimikrobiyal farmakolojinin önemli bir parçasıdır ve klinik ilaç tedavisinin kritik temelidir. Amerika Birleşik Devletleri Klinik ve Laboratuvar Standartları Enstitüsü (CLSI) ve Avrupa Antimikrobiyal Duyarlılık Testi Komitesi (EUCAST), AST ile ilgili uluslararası kriterleri formüle etmiş ve revize etmiş ve AST yöntemlerini ve kesme noktalarını hassas (S), dirençli (R) veya orta (I) olarak belirli bir “organizma-antimikrobiyal ajan” kombinasyonunun MIC’sini belirlemek için sürekli olarak değiştirilmiş ve tamamlamıştır.3, 4.
1980’lerden 1990’lara kadar, otomatik mikro et suyu seyreltme cihazları hızla geliştirildi ve Alfred 60AST, VITEK System, PHOENIXTM ve Cobasbact 5,6,7 gibi örneklerle klinik uygulamaya uygulandı. Bununla birlikte, bu aletler pahalıydı, yüksek maliyetli sarf malzemeleri gerektiriyordu ve tespit aralıkları klinik hasta ilaçları için tasarlandı 5,6,7. Bu nedenlerden dolayı, veteriner klinik muayenesi ve büyük miktarlarda yüksek dirençli suşların tespiti için uygun değildirler. Bu çalışmada, 96 noktalı matris inokülatörü (Şekil 1), görüntü elde etme dönüştürücüsü (Şekil 2) ve ilgili yazılım8’i içeren akıllı, yüksek verimli bir AST / faj tarama sistemi, bir grup bakteri suşu için birden fazla antimikrobiyal ajana karşı aynı anda agar seyreltme yöntemi ile AST’yi yürütmek üzere geliştirilmiştir. Ayrıca sistem, fajların antimikrobiyal dirençli bakterilere karşı lizis paternlerini tespit etmek ve analiz etmek için de kullanıldı9 ve litik fajlar faj kütüphanesinden verimli bir şekilde seçildi. Bu sistemin verimli, uygun fiyatlı ve kullanımı kolay olduğu bulundu.
Şekil 1: 96 noktalı matris aşılayıcının yapısal diyagramı. 1: Aşılama pim plakası; 2: Mobil operatör; 3: Tohum bloğu; 4: İnkübe plakası; 5: Taban; 6: Çalıştırma kolu; 7: Limit pimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Görüntü elde etme dönüştürücüsünün yapısal diyagramı. 1: Kabuk; 2: Görüntü ekranı; 3: Görüntü alma odası; 4: Algılama panosu tabanı; 5: Depo içinde ve dışında algılama panosu; 6: Kontrol panosu; 7: Görüntü alma dönüştürme cihazı; 8: Işık kaynağı; 9: Görüntü tarayıcı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Protocol
Representative Results
Discussion
Agar seyreltme yöntemi iyi kurulmuş ve yaygın olarak kullanılmaktadır. Yüksek verimli AST sisteminin prensibi, agar seyreltme yöntemiydi. Protokoldeki kritik adımlardan biri, arka arkaya birden çok kez gerçekleştirilen 96 aşının tek seferde doğru yüksek verimli transferiydi. Bu kritik adımı tamamlamak için, 96 noktalı matris aşılayıcının pimleri tek tip ve çok pürüzsüzdü. Her bir pimin doğal birikimi yaklaşık 2 μL’lik bir hacimdi ve agar ortamının yüzeyinde küçük damlacıklar halin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Projesi (2019YFA0904003) tarafından desteklenmiştir; Shandong Eyaletinde Modern Tarımsal Endüstriyel Sistem (SDAIT-011-09); Uluslararası İşbirliği Platformu Optimizasyon Projesi (CXGC2023G15); Tarım Bilimleri Akademisi Shandong, Çin’in tarım bilimi ve teknoloji inovasyon projesinin başlıca İnovasyon görevleri (CXGC2023G03).
Materials
| 96 well culture plate | Beijing lanjieke Technology Co., Ltd | 11510 | |
| 96-dot matrix AST image acquisition system | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| 96-dot matrix inoculator | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Agar | Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd | HB8274-1 | |
| Amikacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A857053 | |
| Amoxicillin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A822839 | |
| Ampicillin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A830931 | |
| Analytical balance | Sartorius | BSA224S | |
| Automated calculation software for Lar index of AMR | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Bacteria Salmonella strains | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Animal origin |
| Bacterial resistance Lar index certification management system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Ceftiofur | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C873619 | |
| Ciprofloxacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C824343 | |
| Clavulanic acid | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C824181 | |
| Clean worktable | Suzhou purification equipment Co., Ltd | SW-CJ-2D | |
| Colistin sulfate | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C805491 | |
| Culture plate | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Doxycycline | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | D832390 | |
| Enrofloxacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | E809130 | |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SLGP033RB | |
| Florfenicol | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | F809685 | |
| Gentamicin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | G810322 | |
| Glass bottle 50 mL | Xuzhou Qianxing Glass Technology Co., Ltd | QX-7 | |
| High-throughput resistance detection system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Image acquisition converter | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Meropenem | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | M861173 | |
| Mueller-Hinton agar | Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd | HB6232 | |
| Petri dish 60 mm x 15 mm | Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd | 16021-1 | |
| Petri dish 90 mm x 15 mm | Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd | 16001-1 | |
| Salmonella phages | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | |
| Shaker incubator | Shanghai Minquan Instrument Co., Ltd | MQD-S2R | |
| Turbidimeter | Shanghai XingBai Biotechnology Co., Ltd | F-TC2015 | |
| Varms base type library system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Vertical high-pressure steam sterilizer | Shanghai Shen'an medical instrument factory | LDZX-75L | |
| Veterinary pathogen resistance testing management system | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Veterinary resistance cloud monitoring and phage control platform V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright |
References
- Ramanan, L., et al. Antimicrobial resistance-the need for global solutions. The Lancet Infectious Diseases. 13 (12), 1057-1098 (2013).
- Xiaonan, Z., Qing, Z., Thomas, S. P., Yuqing, L., Martha, R. J. C. inPhocus: Perspectives of the application of bacteriophages in poultry and aquaculture industries based on Varms in China. PHAGE: Therapy, Applications, and Research. 2 (2), 69-74 (2021).
- CLSI. . Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. CLSI document M100. , (2022).
- Yuqing, L., et al. . Antimicrobial Sensitivity Testing Standard of EUCAST. , (2017).
- Barnini, S., et al. A new rapid method for direct antimicrobial susceptibility testing of bacteria from positive blood cultures. BMC Microbiology. 16 (1), 185-192 (2016).
- Höring, S., Massarani, A. S., Löffler, B., Rödel, J. Rapid antimicrobial susceptibility testing in blood culture diagnostics performed by direct inoculation using the VITEK®-2 and BD PhoenixTM platforms. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (3), 471-478 (2019).
- Dupuis, G. Evaluation of the Cobasbact automated antimicrobial susceptibility testing system. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 4 (2), 119-122 (1985).
- Liu, Y., et al. A system of bacterial antimicrobial resistance detection and its operation method. China Patent. , (2019).
- Liu, Y. A high throughput test plate for screening bacteriophage of zoonotic pathogens and its application. China Patent. , (2022).
- Adams, M. H. . Bacteriophages. , (1959).
- Nair, A., Ghugare, G. S., Khairnar, K. An appraisal of bacteriophage isolation techniques from environment. Microbial Ecology. 83 (3), 519-535 (2022).
- . . Shandong veterinary antibiotic resistance system. , (2023).
- Ming, H., et al. Comparison of the results of 96-dot agar dilution method and broth microdilution method. Chinese Journal of Antibiotics. 43 (6), 729-733 (2018).
- Laxminarayan, R., Klugman, K. P. Communicating trends in resistance using a drug resistance index. BMJ Open. 1 (2), e000135 (2011).
- Chen, Y., et al. Assessing antibiotic therapy effectiveness against the major bacterial pathogens in a hospital using an integrated index. Future Microbiology. 12, 853-866 (2017).
- Ciccolini, M., Spoorenberg, V., Geerlings, S. E., Prins, J. M., Grundmann, H. Using an index-based approach to assess the population-level appropriateness of empirical antibiotic therapy. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (1), 286-293 (2015).
- Yanbo, L., et al. Preliminary application of inoculation system for high-throughput drug susceptibility test. China Poultry. 42 (6), 52-57 (2020).
