تطبيق نظام اختبار حساسية مضادات الميكروبات / فحص العاثيات الذكي عالي الإنتاجية ومؤشر لار لمقاومة مضادات الميكروبات
Summary
نقدم هنا مبدأ وهيكل وتعليمات نظام اختبار حساسية مضادات الميكروبات / فحص العاثيات الذكي عالي الإنتاجية. يتضح تطبيقه باستخدام السالمونيلا المعزولة من الدواجن في شاندونغ ، الصين ، كمثال. يتم حساب مؤشر لار ، وتناقش أهميته في تقييم مقاومة مضادات الميكروبات بشكل شامل.
Abstract
لتحسين كفاءة اختبار الحساسية لمضادات الميكروبات (AST) وفحص العاثيات عالية الإنتاجية للبكتيريا المقاومة وتقليل تكلفة الكشف ، تم تطوير نظام ذكي عالي الإنتاجية لفحص AST / phage ، بما في ذلك ملقح مصفوفة 96 نقطة ، ومحول الحصول على الصور ، والبرامج المقابلة ، وفقا لمعايير AST ونقاط توقف المقاومة (R) التي صاغها معهد المعايير السريرية والمخبرية (CLSI). تم إجراء AST وإحصائيات توزيعات الحد الأدنى للتركيز المثبط (MIC) (من R / 8 إلى 8R) ل 1500 سلالة من السالمونيلا المعزولة من الدواجن في شاندونغ ، الصين ، ضد 10 عوامل مضادة للميكروبات بواسطة نظام فحص AST / phage الذكي عالي الإنتاجية. تم الحصول على مؤشر لار ، الذي يعني “مضادات حيوية أقل ، ومقاومة أقل وبقايا حتى القليل من المضادات الحيوية” ، عن طريق حساب المتوسط المرجح لكل MIC والقسمة على R. يحسن هذا النهج الدقة مقارنة باستخدام انتشار المقاومة لتوصيف درجة مقاومة مضادات الميكروبات (AMR) للسلالات عالية المقاومة. بالنسبة لسلالات السالمونيلا ذات مقاومة مضادات الميكروبات العالية ، تم فحص العاثيات المحللة بكفاءة من مكتبة العاثيات بواسطة هذا النظام ، وتم حساب طيف التحلل وتحليله. أظهرت النتائج أن نظام فحص AST / phage الذكي عالي الإنتاجية كان قابلا للتشغيل ودقيقا وعالي الكفاءة وغير مكلف وسهل الصيانة. وإلى جانب نظام شاندونغ لرصد مقاومة مضادات الميكروبات البيطرية، كان النظام مناسبا للبحث العلمي والكشف السريري المتعلق بمقاومة مضادات الميكروبات.
Introduction
نظرا لاستخدام العوامل المضادة للميكروبات على نطاق واسع للوقاية من الأمراض المعدية البكتيرية ، أصبحت مقاومة مضادات الميكروبات (AMR) مشكلة صحية عامة عالمية1. مكافحة مقاومة مضادات الميكروبات هي المهمة الرئيسية الحالية لرصد مقاومة مضادات الميكروبات لمسببات الأمراض الوبائية والعلاج التآزري للعوامل الحساسة المضادة للميكروبات والبكتيريا المحللة2.
اختبار حساسية مضادات الميكروبات في المختبر (AST) هو الدعامة الأساسية لرصد العلاج والكشف عن مستوى مقاومة مضادات الميكروبات. إنه جزء مهم من علم الأدوية المضادة للميكروبات والأساس الحاسم للطب السريري. قام معهد المعايير السريرية والمخبرية (CLSI) التابع للولايات المتحدة واللجنة الأوروبية لاختبار الحساسية لمضادات الميكروبات (EUCAST) بصياغة وتنقيح المعايير الدولية ل AST وتعديل واستكمال طرق AST ونقاط التوقف باستمرار لتحديد MIC لمزيج معين من “العامل المضاد للميكروبات” باعتباره حساسا (S) أو مقاوما (R) أو وسيطا (I) 3 ، 4.
من ثمانينيات القرن العشرين إلى تسعينيات القرن العشرين ، تم تطوير أدوات التخفيف الدقيقة الأوتوماتيكية بسرعة وتطبيقها على الممارسة السريرية ، مع أمثلة تشمل Alfred 60AST و VITEK System و PHOENIXTM و Cobasbact5،6،7. ومع ذلك ، كانت هذه الأدوات باهظة الثمن ، وتتطلب مواد استهلاكية عالية التكلفة ، وتم تصميم نطاقات الكشف الخاصة بها لأدوية المرضى السريرية5،6،7. لهذه الأسباب ، فهي ليست مناسبة للفحص السريري البيطري والكشف عن كميات كبيرة من السلالات شديدة المقاومة. في هذه الدراسة ، تم تطوير نظام فحص AST / phage ذكي عالي الإنتاجية ، بما في ذلك ملقح مصفوفة 96 نقطة (الشكل 1) ، ومحول الحصول على الصور (الشكل 2) ، والبرنامجالمقابل 8 ، لإجراء AST لمجموعة من سلالات البكتيريا ضد عوامل متعددة مضادة للميكروبات في وقت واحد بواسطة طريقة تخفيف أجار. علاوة على ذلك ، تم استخدام النظام أيضا للكشف عن أنماط تحلل العاثيات وتحليلها ضد البكتيريا المقاومة لمضادات الميكروبات9 ، وتم اختيار العاثيات المحللة بكفاءة من مكتبة العاثيات. تم العثور على هذا النظام ليكون فعالا وبأسعار معقولة وسهل التشغيل.
الشكل 1: مخطط إنشائي لملقح المصفوفة المكون من 96 نقطة. 1: لوحة دبوس التلقيح. 2: الناقل المحمول. 3: كتلة البذور. 4: لوحة حضن. 5: قاعدة. 6: مقبض التشغيل. 7: دبوس الحد. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مخطط هيكلي لمحول الحصول على الصور. 1: قذيفة. 2: شاشة عرض. 3: غرفة الحصول على الصور. 4: قاعدة لوحة الكشف. 5: لوحة الكشف داخل وخارج المستودع. 6: لوحة التحكم. 7: جهاز تحويل الحصول على الصور. 8: مصدر الضوء. 9: ماسح الصور. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تأسيس طريقة تخفيف الآجار واستخدامها على نطاق واسع. كان مبدأ نظام AST عالي الإنتاجية هو مبدأ طريقة تخفيف أجار. كانت إحدى الخطوات الحاسمة في البروتوكول هي النقل الدقيق عالي الإنتاجية ل 96 لقاحا في وقت واحد ، والذي تم إجراؤه عدة مرات متتالية. لإكمال هذه الخطوة الحاسمة ، كانت دبابيس ملقح المصف…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل المشروع الوطني للبحث والتطوير الرئيسي (2019YFA0904003) ؛ النظام الصناعي الزراعي الحديث في مقاطعة شاندونغ (SDAIT-011-09) ؛ مشروع تحسين منصة التعاون الدولي (CXGC2023G15)؛ مهام الابتكار الرئيسية لمشروع ابتكار العلوم والتكنولوجيا الزراعية التابع لأكاديمية العلوم الزراعية شاندونغ ، الصين (CXGC2023G03).
Materials
| 96 well culture plate | Beijing lanjieke Technology Co., Ltd | 11510 | |
| 96-dot matrix AST image acquisition system | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| 96-dot matrix inoculator | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Agar | Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd | HB8274-1 | |
| Amikacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A857053 | |
| Amoxicillin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A822839 | |
| Ampicillin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A830931 | |
| Analytical balance | Sartorius | BSA224S | |
| Automated calculation software for Lar index of AMR | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Bacteria Salmonella strains | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Animal origin |
| Bacterial resistance Lar index certification management system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Ceftiofur | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C873619 | |
| Ciprofloxacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C824343 | |
| Clavulanic acid | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C824181 | |
| Clean worktable | Suzhou purification equipment Co., Ltd | SW-CJ-2D | |
| Colistin sulfate | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C805491 | |
| Culture plate | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Doxycycline | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | D832390 | |
| Enrofloxacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | E809130 | |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SLGP033RB | |
| Florfenicol | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | F809685 | |
| Gentamicin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | G810322 | |
| Glass bottle 50 mL | Xuzhou Qianxing Glass Technology Co., Ltd | QX-7 | |
| High-throughput resistance detection system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Image acquisition converter | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Meropenem | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | M861173 | |
| Mueller-Hinton agar | Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd | HB6232 | |
| Petri dish 60 mm x 15 mm | Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd | 16021-1 | |
| Petri dish 90 mm x 15 mm | Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd | 16001-1 | |
| Salmonella phages | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | |
| Shaker incubator | Shanghai Minquan Instrument Co., Ltd | MQD-S2R | |
| Turbidimeter | Shanghai XingBai Biotechnology Co., Ltd | F-TC2015 | |
| Varms base type library system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Vertical high-pressure steam sterilizer | Shanghai Shen'an medical instrument factory | LDZX-75L | |
| Veterinary pathogen resistance testing management system | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Veterinary resistance cloud monitoring and phage control platform V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright |
References
- Ramanan, L., et al. Antimicrobial resistance-the need for global solutions. The Lancet Infectious Diseases. 13 (12), 1057-1098 (2013).
- Xiaonan, Z., Qing, Z., Thomas, S. P., Yuqing, L., Martha, R. J. C. inPhocus: Perspectives of the application of bacteriophages in poultry and aquaculture industries based on Varms in China. PHAGE: Therapy, Applications, and Research. 2 (2), 69-74 (2021).
- CLSI. . Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. CLSI document M100. , (2022).
- Yuqing, L., et al. . Antimicrobial Sensitivity Testing Standard of EUCAST. , (2017).
- Barnini, S., et al. A new rapid method for direct antimicrobial susceptibility testing of bacteria from positive blood cultures. BMC Microbiology. 16 (1), 185-192 (2016).
- Höring, S., Massarani, A. S., Löffler, B., Rödel, J. Rapid antimicrobial susceptibility testing in blood culture diagnostics performed by direct inoculation using the VITEK®-2 and BD PhoenixTM platforms. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (3), 471-478 (2019).
- Dupuis, G. Evaluation of the Cobasbact automated antimicrobial susceptibility testing system. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 4 (2), 119-122 (1985).
- Liu, Y., et al. A system of bacterial antimicrobial resistance detection and its operation method. China Patent. , (2019).
- Liu, Y. A high throughput test plate for screening bacteriophage of zoonotic pathogens and its application. China Patent. , (2022).
- Adams, M. H. . Bacteriophages. , (1959).
- Nair, A., Ghugare, G. S., Khairnar, K. An appraisal of bacteriophage isolation techniques from environment. Microbial Ecology. 83 (3), 519-535 (2022).
- . . Shandong veterinary antibiotic resistance system. , (2023).
- Ming, H., et al. Comparison of the results of 96-dot agar dilution method and broth microdilution method. Chinese Journal of Antibiotics. 43 (6), 729-733 (2018).
- Laxminarayan, R., Klugman, K. P. Communicating trends in resistance using a drug resistance index. BMJ Open. 1 (2), e000135 (2011).
- Chen, Y., et al. Assessing antibiotic therapy effectiveness against the major bacterial pathogens in a hospital using an integrated index. Future Microbiology. 12, 853-866 (2017).
- Ciccolini, M., Spoorenberg, V., Geerlings, S. E., Prins, J. M., Grundmann, H. Using an index-based approach to assess the population-level appropriateness of empirical antibiotic therapy. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (1), 286-293 (2015).
- Yanbo, L., et al. Preliminary application of inoculation system for high-throughput drug susceptibility test. China Poultry. 42 (6), 52-57 (2020).
