Anwendung des intelligenten Hochdurchsatz-Antimikrobiell-Sensitivitätstest-/Phagen-Screening-Systems und des Lar-Index der antimikrobiellen Resistenz
Summary
Hier stellen wir das Prinzip, den Aufbau und die Anleitung des intelligenten Hochdurchsatz-Antimikrobiell-Sensitivitätstest-/Phagen-Screening-Systems vor. Die Anwendung wird am Beispiel von Salmonellen , die aus Geflügel in Shandong, China, isoliert wurden, veranschaulicht. Der Lar-Index wird berechnet und seine Bedeutung für die Bewertung antimikrobieller Resistenzen wird umfassend diskutiert.
Abstract
Um die Effizienz von antimikrobiellen Empfindlichkeitstests (AST) und Phagen-Hochdurchsatz-Screenings auf resistente Bakterien zu verbessern und die Nachweiskosten zu senken, wurde ein intelligentes Hochdurchsatz-AST/Phagen-Screening-System entwickelt, das einen 96-Punkt-Matrix-Inokuultator, einen Bildaufnahmekonverter und eine entsprechende Software umfasst, die den AST-Kriterien und den vom Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI) formulierten Breakpoints of Resistance (R) entsprechen. AST und Statistiken über die Verteilung der minimalen Hemmkonzentration (MIC) (von R/8 bis 8R) von 1.500 Salmonellenstämmen , die aus Geflügel in Shandong, China, gegen 10 antimikrobielle Wirkstoffe isoliert wurden, wurden mit dem intelligenten Hochdurchsatz-AST/Phagen-Screening-System durchgeführt. Der Lar-Index, d.h. “weniger Antibiose, weniger Resistenz und Residuum bis wenig Antibiose”, wurde durch die Berechnung des gewichteten Durchschnitts jedes MHK und die Division durch R ermittelt. Dieser Ansatz verbessert die Genauigkeit im Vergleich zur Verwendung der Prävalenz von Resistenzen zur Charakterisierung des Grades der antimikrobiellen Resistenz (AMR) von hochresistenten Stämmen. Für die Salmonellenstämme mit hoher AMR wurden lytische Phagen mit diesem System effizient aus der Phagenbibliothek gescreent und das Lysespektrum berechnet und analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass das intelligente Hochdurchsatz-AST/Phagen-Screening-System bedienbar, genau, hocheffizient, kostengünstig und einfach zu warten war. In Kombination mit dem veterinärmedizinischen antimikrobiellen Resistenzüberwachungssystem von Shandong war das System für die wissenschaftliche Forschung und den klinischen Nachweis im Zusammenhang mit AMR geeignet.
Introduction
Da antimikrobielle Wirkstoffe in großem Umfang zur Vorbeugung bakterieller Infektionskrankheiten eingesetzt werden, ist die antimikrobielle Resistenz (AMR) zu einem globalen Problem für die öffentliche Gesundheit geworden1. Die Bekämpfung antimikrobieller Resistenzen ist derzeit die Hauptaufgabe der Überwachung von Antibiotikaresistenzen epidemiologischer Krankheitserreger und der synergistischen Therapie empfindlicher antimikrobieller Wirkstoffe und lytischer Bakteriophagen2.
In-vitro-Tests auf antimikrobielle Empfindlichkeit (AST) sind die wichtigste Säule für die Überwachung der Therapie und den Nachweis des AMR-Niveaus. Es ist ein wichtiger Bestandteil der antimikrobiellen Pharmakologie und die entscheidende Grundlage für die klinische Medikation. Das Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) der Vereinigten Staaten und das Europäische Komitee für antimikrobielle Empfindlichkeitstests (EUCAST) haben internationale Kriterien für AST formuliert und überarbeitet und kontinuierlich modifiziert und ergänzt AST-Methoden und die Breakpoints zur Bestimmung der MHK einer bestimmten Kombination aus “Organismus und antimikrobiellem Wirkstoff” als sensitiv (S), resistent (R) oder intermediär (I)3, 4. Anmelden
Von den 1980er bis in die 1990er Jahre wurden schnell automatische Mikrobrühe-Verdünnungsgeräte entwickelt und in der klinischen Praxis eingesetzt, mit Beispielen wie Alfred 60AST, VITEK System, PHOENIXTM und Cobasbact 5,6,7. Diese Instrumente waren jedoch teuer, erforderten teure Verbrauchsmaterialien und ihre Detektionsbereiche waren für die klinische Patientenmedikation ausgelegt 5,6,7. Aus diesen Gründen eignen sie sich nicht für die veterinärklinische Untersuchung und den Nachweis großer Mengen hochresistenter Stämme. In dieser Studie wurde ein intelligentes Hochdurchsatz-AST/Phagen-Screening-System entwickelt, das einen 96-Punkt-Matrix-Inokulator (Abbildung 1), einen Bilderfassungskonverter (Abbildung 2) und die entsprechende Software8 umfasst, um AST für eine Charge von Bakterienstämmen gegen mehrere antimikrobielle Wirkstoffe gleichzeitig mit der Agar-Verdünnungsmethode durchzuführen. Darüber hinaus wurde das System auch verwendet, um die Lysemuster von Phagen gegen antimikrobiell resistente Bakterien zu detektieren und zu analysieren9, und lytische Phagen wurden effizient aus der Phagenbibliothek ausgewählt. Dieses System erwies sich als effizient, erschwinglich und einfach zu bedienen.
Abbildung 1: Strukturdiagramm des 96-Punkt-Matrix-Inokulators. 1: Inokulations-Pin-Platte; 2: Mobilfunkanbieter; 3: Saatblock; 4: Inkubierte Platte; 5: Basis; 6: Bedienungsgriff; 7: Pin begrenzen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Strukturdiagramm des Bildaufnahmekonverters. 1: Schale; 2: Bildschirm anzeigen; 3: Raum für die Bildaufnahme; 4: Basis der Detektionsplatine; 5: Erkennungstafel in und aus dem Lager; 6: Steuerplatine; 7: Bildaufnahme-Konvertierungsgerät; 8: Lichtquelle; 9: Bildscanner. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Agar-Verdünnungsmethode ist gut etabliert und weit verbreitet. Das Prinzip des Hochdurchsatz-AST-Systems war das der Agar-Verdünnungsmethode. Einer der kritischen Schritte innerhalb des Protokolls war der genaue Hochdurchsatztransfer von 96 Inokula auf einmal, der mehrmals hintereinander durchgeführt wurde. Um diesen kritischen Schritt abzuschließen, waren die Pins des 96-Punkt-Matrix-Inokulators gleichmäßig und sehr glatt. Die natürliche Abscheidung jedes Stifts hatte ein Volumen von ca. 2 μl, das sich zu kl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch das National Key Research and Development Project (2019YFA0904003) unterstützt; Modernes landwirtschaftliches Industriesystem in der Provinz Shandong (SDAIT-011-09); Projekt zur Optimierung der internationalen Kooperationsplattform (CXGC2023G15); Wesentliche Innovationsaufgaben des agrarwissenschaftlichen und technologischen Innovationsprojekts der Akademie der Agrarwissenschaften Shandong, China (CXGC2023G03).
Materials
| 96 well culture plate | Beijing lanjieke Technology Co., Ltd | 11510 | |
| 96-dot matrix AST image acquisition system | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| 96-dot matrix inoculator | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Agar | Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd | HB8274-1 | |
| Amikacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A857053 | |
| Amoxicillin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A822839 | |
| Ampicillin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A830931 | |
| Analytical balance | Sartorius | BSA224S | |
| Automated calculation software for Lar index of AMR | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Bacteria Salmonella strains | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Animal origin |
| Bacterial resistance Lar index certification management system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Ceftiofur | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C873619 | |
| Ciprofloxacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C824343 | |
| Clavulanic acid | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C824181 | |
| Clean worktable | Suzhou purification equipment Co., Ltd | SW-CJ-2D | |
| Colistin sulfate | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C805491 | |
| Culture plate | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Doxycycline | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | D832390 | |
| Enrofloxacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | E809130 | |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SLGP033RB | |
| Florfenicol | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | F809685 | |
| Gentamicin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | G810322 | |
| Glass bottle 50 mL | Xuzhou Qianxing Glass Technology Co., Ltd | QX-7 | |
| High-throughput resistance detection system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Image acquisition converter | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Meropenem | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | M861173 | |
| Mueller-Hinton agar | Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd | HB6232 | |
| Petri dish 60 mm x 15 mm | Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd | 16021-1 | |
| Petri dish 90 mm x 15 mm | Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd | 16001-1 | |
| Salmonella phages | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | |
| Shaker incubator | Shanghai Minquan Instrument Co., Ltd | MQD-S2R | |
| Turbidimeter | Shanghai XingBai Biotechnology Co., Ltd | F-TC2015 | |
| Varms base type library system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Vertical high-pressure steam sterilizer | Shanghai Shen'an medical instrument factory | LDZX-75L | |
| Veterinary pathogen resistance testing management system | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Veterinary resistance cloud monitoring and phage control platform V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright |
References
- Ramanan, L., et al. Antimicrobial resistance-the need for global solutions. The Lancet Infectious Diseases. 13 (12), 1057-1098 (2013).
- Xiaonan, Z., Qing, Z., Thomas, S. P., Yuqing, L., Martha, R. J. C. inPhocus: Perspectives of the application of bacteriophages in poultry and aquaculture industries based on Varms in China. PHAGE: Therapy, Applications, and Research. 2 (2), 69-74 (2021).
- CLSI. . Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. CLSI document M100. , (2022).
- Yuqing, L., et al. . Antimicrobial Sensitivity Testing Standard of EUCAST. , (2017).
- Barnini, S., et al. A new rapid method for direct antimicrobial susceptibility testing of bacteria from positive blood cultures. BMC Microbiology. 16 (1), 185-192 (2016).
- Höring, S., Massarani, A. S., Löffler, B., Rödel, J. Rapid antimicrobial susceptibility testing in blood culture diagnostics performed by direct inoculation using the VITEK®-2 and BD PhoenixTM platforms. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (3), 471-478 (2019).
- Dupuis, G. Evaluation of the Cobasbact automated antimicrobial susceptibility testing system. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 4 (2), 119-122 (1985).
- Liu, Y., et al. A system of bacterial antimicrobial resistance detection and its operation method. China Patent. , (2019).
- Liu, Y. A high throughput test plate for screening bacteriophage of zoonotic pathogens and its application. China Patent. , (2022).
- Adams, M. H. . Bacteriophages. , (1959).
- Nair, A., Ghugare, G. S., Khairnar, K. An appraisal of bacteriophage isolation techniques from environment. Microbial Ecology. 83 (3), 519-535 (2022).
- . . Shandong veterinary antibiotic resistance system. , (2023).
- Ming, H., et al. Comparison of the results of 96-dot agar dilution method and broth microdilution method. Chinese Journal of Antibiotics. 43 (6), 729-733 (2018).
- Laxminarayan, R., Klugman, K. P. Communicating trends in resistance using a drug resistance index. BMJ Open. 1 (2), e000135 (2011).
- Chen, Y., et al. Assessing antibiotic therapy effectiveness against the major bacterial pathogens in a hospital using an integrated index. Future Microbiology. 12, 853-866 (2017).
- Ciccolini, M., Spoorenberg, V., Geerlings, S. E., Prins, J. M., Grundmann, H. Using an index-based approach to assess the population-level appropriateness of empirical antibiotic therapy. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (1), 286-293 (2015).
- Yanbo, L., et al. Preliminary application of inoculation system for high-throughput drug susceptibility test. China Poultry. 42 (6), 52-57 (2020).
