Yumurtalık Ameliyatlı Fare Modelinde Gebelik Oluşumuna Uterus Katkılarını İnceleme Yöntemleri
Summary
Gebelik oluşumu, kompleks embriyo ve uterus çapraz ilişkisini içeren dinamik bir süreçtir. Maternal uterin ortamın bu süreçlere kesin katkıları aktif bir araştırma alanı olmaya devam etmektedir. Burada, bu araştırma sorularını ele almak için in vivo hayvan modellerinin tasarlanmasına yardımcı olacak ayrıntılı protokoller sağlanmaktadır.
Abstract
Gebeliğin oluşması için, uygulanabilir bir blastosist, implantasyonu ve plasenta oluşumunu kolaylaştırmak ve devam eden hamileliği sağlamak için alıcı bir uterus astarı (endometriyum) ile başarılı bir şekilde etkileşime girmelidir. Embriyonik defektlerin neden olduğu gebelik başarısındaki sınırlamalar iyi bilinmektedir ve son yıllarda in vitro fertilizasyon (IVF) ve yardımcı üreme teknolojilerinin yükselişiyle büyük ölçüde aşılmıştır. Bununla birlikte, henüz, alan, yetersiz alıcı bir endometriyumun neden olduğu sınırlamaların üstesinden gelmemiştir, bu nedenle IVF başarı oranlarının durgunlaşmasına neden olmuştur. Yumurtalık ve endometriyal fonksiyonlar yakından iç içe geçmiştir, çünkü yumurtalık tarafından üretilen hormonlar endometriyumun adet siklikliğinden sorumludur. Bu nedenle, gebeliğin kemirgen modellerini kullanırken, gözlemlenen bir sonucun yumurtalık veya uterus eksikliğinden kaynaklanıp kaynaklanmadığını belirlemek zor olabilir. Bunun üstesinden gelmek için, gebeliğe uterusa özgü katkıların incelenmesine izin vermek için embriyo transferi veya yapay desidualizasyon ile yumurtalık ameliyatı yapılmış bir fare modeli geliştirilmiştir. Bu makalede, yumurtalık ameliyatının nasıl yapılacağına dair talimatlar verilecek ve sağlıklı donörlerden embriyo transferini takiben başarılı yapay desidualizasyonu veya hamileliği desteklemek için eksojen hormonların temini için çeşitli teknikler hakkında bilgi verilecektir. Bu teknikler arasında deri altı enjeksiyonu, yavaş salınımlı peletler ve ozmotik mini pompalar bulunur. Her yöntemin temel avantajları ve dezavantajları tartışılacak ve araştırmacıların kendi araştırma soruları için en iyi çalışma tasarımını seçmelerini sağlayacaktır.
Introduction
Son yıllarda yardımcı üreme teknolojilerinin kullanımının artmasıyla birlikte, gebe kalmanın önündeki birçok engel aşılmış ve birçok çiftin doğurganlık sorunlarına rağmen aile kurmasına izin verilmiştir1. Oosit veya sperm eksiklikleri genellikle in vitro fertilizasyon veya intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu kullanılarak atlanabilir; Bununla birlikte, uterus ve endometriyal alıcılık ile ilgili konular, üreme potansiyelinin zor bir “kara kutusu” olmaya devam etmektedir2.
Hamilelik, yüksek kaliteli bir embriyo alıcı bir endometriyum (uterus astarı) ile başarılı bir şekilde etkileşime girdiğinde kurulur. Herhangi bir adet döngüsünde başarılı hamilelik şansı düşüktür, yaklaşık% 30’dur3,4. Başarılı olanların sadece% 50-60’ı gebeliğin 20. haftasını geçerek ilerler ve implantasyon başarısızlığı 20 haftaya ulaşmayan gebeliklerin% 75’inden sorumludur3. 1990’ların sonlarına kadar uzanan bu rakamlara rağmen, alan henüz yetersiz alıcı bir endometriyumun neden olduğu sınırlamaların üstesinden gelememiştir. Bu, son yıllarda IVF başarı oranlarının durgunlaşmasına ve bazen de düşmesine neden olmuştur 5,6.
Açıklanamayan infertilitesi olan kadınlar genellikle yer değiştirmiş bir alıcılık penceresine sahiptir veya bilinmeyen nedenlerden dolayı alıcılığa ulaşamazlar. Son zamanlarda, embriyo transferinin zamanlamasını bireyin alıcılık penceresine uyarlamak amacıyla yüzlerce genin ekspresyonunu değerlendiren endometrial reseptivite dizisi geliştirilmiştir 7,8,9. Bununla birlikte, implantasyon süreci tamamlandıktan sonra ortaya çıkan gebelik komplikasyonlarının patogenezi hala anlaşılamamıştır.
Kadın üreme sistemi oldukça dinamiktir ve sıkı hormonal kontrol altındadır. Hipotalamik-hipofiz-gonadal (HPG) ekseni, folikül olgunlaşması ve östrojen ve progesteron aktivitesi dahil olmak üzere yumurtalık döngüsünün yönlerini düzenleyen luteinize edici hormon ve folikül uyarıcı hormonun salınımını kontrol eder. Buna karşılık, uterus adet döngüsü östrojenler ve progesteron10,11 tarafından düzenlenir. Bu nedenle, uterus biyolojik mekanizmalarının incelenmesi yumurtalık etkisi ile karmaşıktır. Örneğin, kanser tedavilerinin uterusu nasıl etkileyebileceğini incelerken, gözlemlenen herhangi bir uterus fenotipinin (gebelik kaybı veya adet aklikliği gibi) uterusa doğrudan bir hakaretin sonucu mu yoksa yumurtalıklara verilen hasardan kaynaklanan bir sonuç mu olduğunu ayırt etmek zor olabilir.
Doğurganlığı kapsamlı bir şekilde anlamak için, gebeliğe uterus katkıları karakterize edilmelidir. Önemli olarak, bu anlayış yumurtalık kontrolü altında uterus fonksiyonunun ötesine geçmelidir. Bu insanlarda incelenemez; Bu nedenle, hayvan modelleri sıklıkla kullanılır. Bu nedenle, ovariektomi (OVX), araştırmacıların eksojen olarak hormon sağlayarak kemirgen östrus döngülerini (adet döngüsüne benzer) düzenlemelerini sağlamak için yaygın olarak kullanılır. Ek olarak, OVX, uterus yanıtlarının yumurtalık etkisinden bağımsız olarak incelenmesine izin verir12. Bununla birlikte, hormonlar OVX sonrası hemen sağlanmazsa, araştırmacılar tarafından dikkatlice düşünülmesi gereken bir menopoz fenotipi ortaya çıkacaktır.
OVX, 13,14,15,16,17 kemirgen modellerinde sıklıkla kullanılır ve yeterli eğitimden sonra gerçekleştirilmesi nispeten kolaydır. Yöntemler, tek başına yumurtalığın mı yoksa yumurtalık ve yumurta kanalının mı çıkarıldığına ve hayvanın yaşına bağlı olarak değişir (yetişkin, bisiklete binen hayvanlar, yüzeylerinde görünür bir korpus luteum bulunan daha büyük yumurtalıklara sahiptir, yani yumurtalıklarının görselleştirilmesi daha kolaydır). Benzer şekilde, deri altı enjeksiyonları14, yavaş salınımlı peletler 15, ozmotik mini pompalar18 ve yumurtalık aşılaması dahil olmak üzere birçok hormon takviyesi yöntemi mevcuttur.
Bu makalede, yumurtalık ameliyatının nasıl yapılacağı ve deri altı enjeksiyonları, yavaş salınımlı peletler ve ozmotik mini pompalar dahil olmak üzere üç tip hormon takviyesinin nasıl hazırlanacağı hakkında ayrıntılı talimatlar verilmiştir. OVX’ten yararlanan deneysel sonlanım noktaları için iki ayrıntılı protokol ve ardından eksojen hormon takviyesi (embriyo transferi ve yapay desidualizasyon) sağlanmıştır. Bu makalede, özellikle hamilelik ve doğurganlık araştırma alanlarında, rahim üzerindeki etkileri izole etmek için çalışmaların nasıl yapılacağı konusunda araştırmacılara rehberlik etmek amacıyla her yaklaşımın güçlü ve zayıf yönleri tartışılmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makale, OVX’in nasıl gerçekleştirileceği ve uterusun hamilelik ve doğurganlığa katkılarını anlamaya odaklanan çalışmalar için eksojen hormonların nasıl sağlanacağı konusunda adım adım talimatlar sunmaktadır. Bu yöntemlerin iki deneysel uygulamasında, embriyo transferinin gerçekleştirilmesi ve desidualizasyonun yapay olarak indüklenmesi de dahil olmak üzere iki ayrıntılı protokol sağlanmıştır.
OVX’i gerçekleştirmek başlangıçta zor olsa da – özellikle …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Victoria Eyalet Hükümeti Operasyonel Altyapı Desteği ve Avustralya Hükümeti Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (NHMRC) IRIISS aracılığıyla mümkün olmuştur. Bu çalışma, Monash Üniversitesi Tıp Fakültesi, Hemşirelik ve Sağlık Bilimleri Platformu Erişim Hibesi tarafından A.L.W.’ye (Winship-PAG18-0343) Monash Üreme Hizmetleri Platformu’na erişim için desteklenmiştir. A.L.W., Avustralya Araştırma Konseyi’nden (ARC) DECRA fonu DE21010037 tarafından desteklenmektedir. J.N.H. ve L.R.A., Avustralya Hükümeti Araştırma Eğitim Programı Bursu ile desteklenmektedir. L.R.A. Monash Graduate Excellence Bursu ile desteklenmektedir. K.J.H. ARC Future Fellowship FT190100265 tarafından desteklenmektedir.
Materials
| ALZET 1002 mini osmotic pumps | BioScientifica | 1002 | Delivers 0.25 µL/h for 14 days. Use for section 7 (Experimental procedure – Embryo transfer). |
| ALZET 1003D mini osmotic pumps | BioScientifica | 1003D | Delivers 1 µL/h for 14 days. Use for section 8 (Experimental procedure – Artificial decidualization). |
| ALZET Reflex 7 mm clips | BioScientifica | 0009971 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| ALZET Reflex clip applicator | BioScientifica | 0009974 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| ALZET Reflex clip remover | BioScientifica | 0009976 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| Bupivicaine injection | Pfizer | NA | Stock 0.5%. Use at 0.05% in saline |
| Estradiol | Sigma | E8875 | |
| Meloxicam | Ilium | NA | Active constituent 0.5 mg/mL. Use 3.5 mL per 200 mL cage bottle, or as your institutions vet prescribes. |
| Michel clips | Daniels | NS-000242 | |
| Multi purpose sealant | Dow Corning | 732 | |
| Non-surgical embryo transfer (NSET) device | ParaTechs | 60010 | Contains 6 mm speculum. Single use only. |
| Progesterone | Sigma | P0130 | Soluble in ethanol. Use for section 3 (Hormone preparation – subcutaneous injection) and section 4 (Hormone preparation – slow-release pellets) |
| Progesterone | Sigma | P7556 | Soluble in water. Use for section 5 (Hormone preparation – osmotic mini pumps) |
| Refresh eye ointment | Allergan | NA | 42.5% w/v liquid paraffin, 57.3% w/v soft white paraffin |
| Rimadyl Carprofen | Zoetis | NA | Stock 50 mg/mL. Use at 5 mg/kg |
| Rubber tubing | Dow Corning | 508-008 | Washed in 100% ethanol and cut into 1 cm pieces. Inside diameter 1.57 mm ± 0.23 mm; outside diamater 3.18 mm ± 0.23 mm; wall 0.81 mm. |
| Sesame oil | Sigma | S3547 | |
| Sofsilk Silk sutures size 3-0 | Covidien | GS-832 |
References
- Szamatowicz, M. Assisted reproductive technology in reproductive medicine – Possibilities and limitations. Ginekologia Polska. 87 (12), 820-823 (2016).
- Evans, J., et al. Fertile ground: Human endometrial programming and lessons in health and disease. Nature Reviews. Endocrinology. 12 (11), 654-667 (2016).
- Norwitz, E. R., Schust, D. J., Fisher, S. J. Implantation and the survival of early pregnancy. The New England Journal of Medicine. 345 (19), 1400-1408 (2001).
- Zinaman, M. J., Clegg, E. D., Brown, C. C., O’Connor, J., Selevan, S. G. Estimates of human fertility and pregnancy loss. Fertility & Sterility. 65 (3), 503-509 (1996).
- Kupka, M. S., et al. Assisted reproductive technology in Europe, 2010: Results generated from European registers by ESHRE†. Human Reproduction. 29 (10), 2099-2113 (2014).
- Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. Worldwide decline of IVF birth rates and its probable causes. Human Reproduction Open. 2019 (3), (2019).
- Diaz-Gimeno, P., et al. A genomic diagnostic tool for human endometrial receptivity based on the transcriptomic signature. Fertility & Sterility. 95 (1), 50-60 (2011).
- Amin, J., et al. Personalized embryo transfer outcomes in recurrent implantation failure patients following endometrial receptivity array with pre-implantation genetic testing. Cureus. 14 (6), e26248 (2022).
- Patel, J. A., Patel, A. J., Banker, J. M., Shah, S. I., Banker, M. R. Personalized embryo transfer helps in improving in vitro fertilization/ICSI outcomes in patients with recurrent implantation failure. Journal of Human Reproductive Sciences. 12 (1), 59-66 (2019).
- Khan, K. N., et al. Biological differences between functionalis and basalis endometria in women with and without adenomyosis. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 203, 49-55 (2016).
- Richards, J. S., Ren, Y. A., Candelaria, N., Adams, J. E., Rajkovic, A. Ovarian follicular theca cell recruitment, differentiation, and impact on fertility: 2017 update. Endocrine Reviews. 39 (1), 1-20 (2018).
- Corciulo, C., et al. Pulsed administration for physiological estrogen replacement in mice. F1000Research. 10, 809 (2021).
- Greaves, E., et al. A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium. The American Journal of Pathology. 184 (7), 1930-1939 (2014).
- Griffiths, M. J., Alesi, L. R., Winship, A. L., Hutt, K. J. Development of an embryo transfer model to study uterine contributions to pregnancy in vivo in mice. Reproduction & Fertility. 3 (1), 10-18 (2022).
- Cousins, F. L., et al. Evidence from a mouse model that epithelial cell migration and mesenchymal-epithelial transition contribute to rapid restoration of uterine tissue integrity during menstruation. PLoS One. 9 (1), e86378 (2014).
- Cousins, F. L., et al. Androgens regulate scarless repair of the endometrial "wound" in a mouse model of menstruation. FASEB Journal. 30 (8), 2802-2811 (2016).
- Fullerton, P. T., Monsivais, D., Kommagani, R., Matzuk, M. M. Follistatin is critical for mouse uterine receptivity and decidualization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (24), E4772-E4781 (2017).
- Rowland, R. R., Reyes, E., Chukwuocha, R., Tokuda, S. Corticosteroid and immune responses of mice following mini-osmotic pump implantation. Immunopharmacology. 20 (3), 187-190 (1990).
- Barton, B. E., et al. Roles of steroid hormones in oviductal function. Reproduction. 159 (3), R125-R137 (2020).
- Lee, J. E., et al. Autophagy regulates embryonic survival during delayed implantation. Endocrinology. 152 (5), 2067-2075 (2011).
- Hamatani, T., et al. Global gene expression analysis identifies molecular pathways distinguishing blastocyst dormancy and activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (28), 10326-10331 (2004).
- Cui, L., et al. Transcervical embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (3), 228-231 (2014).
