Méthodes d’étude des contributions utérines à l’établissement de la grossesse dans un modèle murin ovariectomisé
Summary
L’établissement de la grossesse est un processus dynamique impliquant une diaphonie embryonnaire et utérine complexe. Les contributions précises de l’environnement utérin maternel à ces processus restent un domaine de recherche actif. Ici, des protocoles détaillés sont fournis pour aider à concevoir des modèles animaux in vivo pour répondre à ces questions de recherche.
Abstract
Pour qu’une grossesse soit établie, un blastocyste viable doit interagir avec succès avec une muqueuse utérine réceptive (endomètre) pour faciliter l’implantation et la formation de placenta et permettre la poursuite de la grossesse. Les limites au succès de la grossesse causées par des anomalies embryonnaires sont bien connues et ont été largement surmontées au cours des dernières décennies avec l’essor de la fécondation in vitro (FIV) et des technologies de procréation assistée. Jusqu’à présent, cependant, le domaine n’a pas surmonté les limitations causées par un endomètre insuffisamment réceptif, ce qui entraîne une stagnation des taux de réussite de la FIV. Les fonctions ovarienne et endométriale sont étroitement liées, car les hormones produites par l’ovaire sont responsables de la cyclicité menstruelle de l’endomètre. En tant que tel, lors de l’utilisation de modèles de grossesse chez les rongeurs, il peut être difficile de déterminer si un résultat observé est dû à un déficit ovarien ou utérin. Pour surmonter cela, un modèle murin ovariectomisé a été développé avec transfert d’embryons ou décidualisation artificielle pour permettre l’étude des contributions spécifiques utérines à la grossesse. Cet article fournira des instructions sur la façon d’effectuer une ovariectomie et offrira un aperçu de diverses techniques pour fournir des hormones exogènes afin de soutenir une décidualisation artificielle ou une grossesse réussie après le transfert d’embryons de donneurs sains. Ces techniques comprennent l’injection sous-cutanée, les pastilles à libération lente et les mini-pompes osmotiques. Les principaux avantages et inconvénients de chaque méthode seront discutés, ce qui permettra aux chercheurs de choisir le meilleur plan d’étude pour leur question de recherche spécifique.
Introduction
Avec l’utilisation croissante des technologies de procréation assistée au cours des dernières décennies, de nombreux obstacles à la conception ont été surmontés, permettant à de nombreux couples de fonder une famille malgré les problèmes de fertilité1. Les déficits ovocytaires ou spermatozoïdes peuvent souvent être contournés par fécondation in vitro ou injection intracytoplasmique de spermatozoïdes; Cependant, les problèmes liés à la réceptivité de l’utérus et de l’endomètre restent une « boîte noire » insaisissable du potentiel reproducteur2.
La grossesse est établie lorsqu’un embryon de haute qualité interagit avec succès avec un endomètre réceptif (muqueuse utérine). Les chances de réussite de la grossesse dans un cycle menstruel donné sont faibles, à environ 30%3,4. Parmi celles qui réussissent, seulement 50% à 60% avancent au-delà de 20 semaines de gestation, l’échec de l’implantation étant responsable de 75% des grossesses qui n’atteignent pas 20 semaines3. Malgré ces chiffres datant de la fin des années 1990, le domaine n’a pas encore surmonté les limites causées par un endomètre insuffisamment réceptif. Cela a entraîné une stagnation – et parfois une baisse – des taux de réussite de la FIV au cours des dernières années 5,6.
Les femmes souffrant d’infertilité inexpliquée ont souvent une fenêtre de réceptivité déplacée ou sont incapables d’atteindre la réceptivité pour des raisons inconnues. Récemment, le réseau de réceptivité de l’endomètre a été développé, qui évalue l’expression de centaines de gènes dans le but d’adapter le moment du transfert d’embryons à la fenêtre de réceptivité d’un individu 7,8,9. Cependant, le domaine manque encore de compréhension de la pathogenèse des complications de la grossesse qui se manifestent après la fin du processus d’implantation.
Le système reproducteur féminin est très dynamique et sous contrôle hormonal étroit. L’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique (HPG) contrôle la libération de l’hormone lutéinisante et de l’hormone folliculo-stimulante, qui régulent les aspects du cycle ovarien, y compris la maturation des follicules et l’activité des œstrogènes et de la progestérone. À son tour, le cycle menstruel utérin est régulé par les œstrogènes et la progestérone10,11. Ainsi, l’étude des mécanismes biologiques utérins est compliquée par l’influence ovarienne. Par exemple, lorsque l’on étudie l’impact des thérapies anticancéreuses sur l’utérus, il peut être difficile de distinguer si un phénotype utérin observé (comme une perte de grossesse ou une acyclique menstruelle) est le résultat d’une insulte directe à l’utérus ou d’un effet consécutif de dommages aux ovaires.
Pour bien comprendre la fertilité, les contributions utérines à la grossesse doivent être caractérisées. Il est important de noter que cette compréhension doit s’étendre au-delà de la fonction utérine sous contrôle ovarien. Cela ne peut pas être étudié chez l’homme; Par conséquent, des modèles animaux sont souvent utilisés. En tant que telle, l’ovariectomie (OVX) est couramment utilisée pour permettre aux chercheurs de réguler les cycles œstraux des rongeurs (analogues au cycle menstruel) en fournissant des hormones exogènes. De plus, OVX permet d’étudier les réponses utérines indépendamment de l’influence ovarienne12. Cependant, si les hormones ne sont pas immédiatement fournies après OVX, un phénotype de ménopause finira par apparaître, ce qui doit être soigneusement examiné par les chercheurs.
OVX est fréquemment utilisé dans les modèles de rongeurs 13,14,15,16,17 et est relativement facile à réaliser après un entraînement adéquat. Les méthodes varient selon que l’ovaire seul ou l’ovaire et l’oviducte sont enlevés, ainsi que selon l’âge de l’animal (adultes, les animaux cyclistes ont des ovaires plus gros avec un corps jaune visible à leur surface, ce qui signifie que leurs ovaires sont plus faciles à visualiser). De même, de nombreuses méthodes de supplémentation hormonale existent, notamment les injections sous-cutanées14, les pastilles à libération lente 15, les minipompes osmotiques18 et la greffe ovarienne.
Dans cet article, des instructions détaillées sont fournies sur la façon d’effectuer une ovariectomie et de préparer trois types de supplémentation hormonale, y compris les injections sous-cutanées, les granulés à libération lente et les mini-pompes osmotiques. Deux protocoles détaillés sont fournis pour les critères expérimentaux qui bénéficient d’OVX suivi d’une supplémentation en hormones exogènes (transfert d’embryons et décidualisation artificielle). Cet article traite des forces et des faiblesses de chaque approche dans le but de guider les chercheurs sur la façon de mener des études pour isoler les impacts sur l’utérus, en particulier dans les domaines de la grossesse et de la fertilité.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cet article fournit des instructions étape par étape sur la façon d’effectuer OVX et de fournir des hormones exogènes pour les études axées sur la compréhension des contributions utérines à la grossesse et à la fertilité. Deux protocoles détaillés sont fournis sur deux applications expérimentales de ces méthodes, y compris la réalisation du transfert d’embryons et l’induction artificielle de la décidualisation.
Bien que la réalisation d’OVX puisse être difficile au d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été rendu possible grâce au soutien de l’infrastructure opérationnelle du gouvernement de l’État de Victoria et à l’IRIRIISS du Conseil national de la santé et de la recherche médicale (NHMRC) du gouvernement australien. Ce travail a été soutenu par la subvention d’accès à la plateforme de la Faculté de médecine, des soins infirmiers et des sciences de la santé de l’Université Monash à A.L.W. (Winship-PAG18-0343) pour accéder à la plate-forme Monash Reproductive Services. A.L.W. est soutenu par le financement DECRA DE21010037 de l’Australian Research Council (ARC). J.N.H. et L.R.A. sont soutenus par une bourse du programme de formation à la recherche du gouvernement australien. L.R.A. est soutenu par une bourse d’excellence Monash. K.J.H. est soutenu par une bourse ARC Future FT190100265.
Materials
| ALZET 1002 mini osmotic pumps | BioScientifica | 1002 | Delivers 0.25 µL/h for 14 days. Use for section 7 (Experimental procedure – Embryo transfer). |
| ALZET 1003D mini osmotic pumps | BioScientifica | 1003D | Delivers 1 µL/h for 14 days. Use for section 8 (Experimental procedure – Artificial decidualization). |
| ALZET Reflex 7 mm clips | BioScientifica | 0009971 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| ALZET Reflex clip applicator | BioScientifica | 0009974 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| ALZET Reflex clip remover | BioScientifica | 0009976 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| Bupivicaine injection | Pfizer | NA | Stock 0.5%. Use at 0.05% in saline |
| Estradiol | Sigma | E8875 | |
| Meloxicam | Ilium | NA | Active constituent 0.5 mg/mL. Use 3.5 mL per 200 mL cage bottle, or as your institutions vet prescribes. |
| Michel clips | Daniels | NS-000242 | |
| Multi purpose sealant | Dow Corning | 732 | |
| Non-surgical embryo transfer (NSET) device | ParaTechs | 60010 | Contains 6 mm speculum. Single use only. |
| Progesterone | Sigma | P0130 | Soluble in ethanol. Use for section 3 (Hormone preparation – subcutaneous injection) and section 4 (Hormone preparation – slow-release pellets) |
| Progesterone | Sigma | P7556 | Soluble in water. Use for section 5 (Hormone preparation – osmotic mini pumps) |
| Refresh eye ointment | Allergan | NA | 42.5% w/v liquid paraffin, 57.3% w/v soft white paraffin |
| Rimadyl Carprofen | Zoetis | NA | Stock 50 mg/mL. Use at 5 mg/kg |
| Rubber tubing | Dow Corning | 508-008 | Washed in 100% ethanol and cut into 1 cm pieces. Inside diameter 1.57 mm ± 0.23 mm; outside diamater 3.18 mm ± 0.23 mm; wall 0.81 mm. |
| Sesame oil | Sigma | S3547 | |
| Sofsilk Silk sutures size 3-0 | Covidien | GS-832 |
References
- Szamatowicz, M. Assisted reproductive technology in reproductive medicine – Possibilities and limitations. Ginekologia Polska. 87 (12), 820-823 (2016).
- Evans, J., et al. Fertile ground: Human endometrial programming and lessons in health and disease. Nature Reviews. Endocrinology. 12 (11), 654-667 (2016).
- Norwitz, E. R., Schust, D. J., Fisher, S. J. Implantation and the survival of early pregnancy. The New England Journal of Medicine. 345 (19), 1400-1408 (2001).
- Zinaman, M. J., Clegg, E. D., Brown, C. C., O’Connor, J., Selevan, S. G. Estimates of human fertility and pregnancy loss. Fertility & Sterility. 65 (3), 503-509 (1996).
- Kupka, M. S., et al. Assisted reproductive technology in Europe, 2010: Results generated from European registers by ESHRE†. Human Reproduction. 29 (10), 2099-2113 (2014).
- Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. Worldwide decline of IVF birth rates and its probable causes. Human Reproduction Open. 2019 (3), (2019).
- Diaz-Gimeno, P., et al. A genomic diagnostic tool for human endometrial receptivity based on the transcriptomic signature. Fertility & Sterility. 95 (1), 50-60 (2011).
- Amin, J., et al. Personalized embryo transfer outcomes in recurrent implantation failure patients following endometrial receptivity array with pre-implantation genetic testing. Cureus. 14 (6), e26248 (2022).
- Patel, J. A., Patel, A. J., Banker, J. M., Shah, S. I., Banker, M. R. Personalized embryo transfer helps in improving in vitro fertilization/ICSI outcomes in patients with recurrent implantation failure. Journal of Human Reproductive Sciences. 12 (1), 59-66 (2019).
- Khan, K. N., et al. Biological differences between functionalis and basalis endometria in women with and without adenomyosis. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 203, 49-55 (2016).
- Richards, J. S., Ren, Y. A., Candelaria, N., Adams, J. E., Rajkovic, A. Ovarian follicular theca cell recruitment, differentiation, and impact on fertility: 2017 update. Endocrine Reviews. 39 (1), 1-20 (2018).
- Corciulo, C., et al. Pulsed administration for physiological estrogen replacement in mice. F1000Research. 10, 809 (2021).
- Greaves, E., et al. A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium. The American Journal of Pathology. 184 (7), 1930-1939 (2014).
- Griffiths, M. J., Alesi, L. R., Winship, A. L., Hutt, K. J. Development of an embryo transfer model to study uterine contributions to pregnancy in vivo in mice. Reproduction & Fertility. 3 (1), 10-18 (2022).
- Cousins, F. L., et al. Evidence from a mouse model that epithelial cell migration and mesenchymal-epithelial transition contribute to rapid restoration of uterine tissue integrity during menstruation. PLoS One. 9 (1), e86378 (2014).
- Cousins, F. L., et al. Androgens regulate scarless repair of the endometrial "wound" in a mouse model of menstruation. FASEB Journal. 30 (8), 2802-2811 (2016).
- Fullerton, P. T., Monsivais, D., Kommagani, R., Matzuk, M. M. Follistatin is critical for mouse uterine receptivity and decidualization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (24), E4772-E4781 (2017).
- Rowland, R. R., Reyes, E., Chukwuocha, R., Tokuda, S. Corticosteroid and immune responses of mice following mini-osmotic pump implantation. Immunopharmacology. 20 (3), 187-190 (1990).
- Barton, B. E., et al. Roles of steroid hormones in oviductal function. Reproduction. 159 (3), R125-R137 (2020).
- Lee, J. E., et al. Autophagy regulates embryonic survival during delayed implantation. Endocrinology. 152 (5), 2067-2075 (2011).
- Hamatani, T., et al. Global gene expression analysis identifies molecular pathways distinguishing blastocyst dormancy and activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (28), 10326-10331 (2004).
- Cui, L., et al. Transcervical embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (3), 228-231 (2014).
