Methoden voor het bestuderen van baarmoederbijdragen aan zwangerschapsinstelling in een ovariectomiemodel
Summary
Zwangerschapsvorming is een dynamisch proces met complexe embryo- en baarmoederkruisverwijzing. De precieze bijdragen van de maternale baarmoederomgeving aan deze processen blijven een actief onderzoeksgebied. Hier worden gedetailleerde protocollen verstrekt om te helpen bij het ontwerpen van in vivo diermodellen om deze onderzoeksvragen aan te pakken.
Abstract
Om zwangerschap vast te stellen, moet een levensvatbare blastocyst met succes interageren met een receptief baarmoederslijmvlies (endometrium) om implantatie en placentavorming te vergemakkelijken en een voortdurende zwangerschap mogelijk te maken. De beperkingen van zwangerschapssucces veroorzaakt door embryonale defecten zijn bekend en zijn de afgelopen decennia grotendeels overwonnen met de opkomst van in-vitrofertilisatie (IVF) en geassisteerde voortplantingstechnologieën. Tot nu toe heeft het veld echter de beperkingen die worden veroorzaakt door een onvoldoende ontvankelijk endometrium niet overwonnen, wat resulteert in stagnerende IVF-slagingspercentages. Ovariële en endometriumfuncties zijn nauw met elkaar verweven, omdat hormonen die door de eierstok worden geproduceerd verantwoordelijk zijn voor de menstruatiecycliciteit van het endometrium. Als zodanig kan het bij het gebruik van knaagdiermodellen van zwangerschap moeilijk zijn om vast te stellen of een waargenomen resultaat te wijten is aan een ovariële of baarmoedertekort. Om dit te ondervangen, werd een ovariectomie muismodel ontwikkeld met embryotransfer of kunstmatige decidualisatie om de studie van baarmoederspecifieke bijdragen aan de zwangerschap mogelijk te maken. Dit artikel geeft instructies over het uitvoeren van ovariëctomie en biedt inzicht in verschillende technieken voor het leveren van exogene hormonen ter ondersteuning van succesvolle kunstmatige decidualisatie of zwangerschap na embryotransfer van gezonde donoren. Deze technieken omvatten subcutane injectie, pellets met langzame afgifte en osmotische minipompen. De belangrijkste voor- en nadelen van elke methode worden besproken, zodat onderzoekers de beste onderzoeksopzet voor hun specifieke onderzoeksvraag kunnen kiezen.
Introduction
Met het toenemende gebruik van geassisteerde reproductieve technologieën in de afgelopen decennia, zijn veel barrières voor conceptie overwonnen, waardoor veel paren een gezin kunnen stichten ondanks vruchtbaarheidsproblemen1. Oöcyten- of spermatekorten kunnen vaak worden omzeild met behulp van in-vitrofertilisatie of intracytoplasmatische sperma-injectie ; Problemen met betrekking tot de baarmoeder en endometriumreceptiviteit blijven echter een ongrijpbare “zwarte doos” van voortplantingspotentieel2.
Zwangerschap wordt vastgesteld wanneer een embryo van hoge kwaliteit met succes interageert met een receptief endometrium (baarmoederslijmvlies). De kans op een succesvolle zwangerschap in een bepaalde menstruatiecyclus is laag, rond de 30%3,4. Van degenen die succesvol zijn, gaat slechts 50% -60% verder dan 20 weken zwangerschap, waarbij implantatiefalen verantwoordelijk is voor 75% van de zwangerschappen die 20 weken niet bereiken3. Ondanks deze cijfers die dateren uit de late jaren 1990, moet het veld nog steeds de beperkingen overwinnen die worden veroorzaakt door een onvoldoende ontvankelijk endometrium. Dit heeft geresulteerd in stagnerende – en soms dalende – IVF-slagingspercentages in de afgelopen jaren 5,6.
Vrouwen met onverklaarbare onvruchtbaarheid hebben vaak een verplaatst venster van ontvankelijkheid of zijn om onbekende redenen niet in staat om ontvankelijkheid te bereiken. Onlangs is de endometriumreceptiviteitsarray ontwikkeld, die de expressie van honderden genen beoordeelt met als doel de timing van embryotransfer aan te passen aan het venster van ontvankelijkheid van een individu 7,8,9. Het veld mist echter nog steeds een goed begrip van de pathogenese van zwangerschapscomplicaties die zich manifesteren nadat het implantatieproces is voltooid.
Het vrouwelijke voortplantingssysteem is zeer dynamisch en staat onder strakke hormonale controle. De hypothalamus-hypofyse-gonadale (HPG) as regelt de afgifte van luteïniserend hormoon en follikelstimulerend hormoon, die aspecten van de ovariële cyclus reguleren, waaronder follikelrijping en oestrogeen- en progesteronactiviteit. Op zijn beurt wordt de baarmoedermenstruele cyclus gereguleerd door oestrogenen en progesteron10,11. Het bestuderen van baarmoederbiologische mechanismen wordt dus bemoeilijkt door ovariële invloed. Bij het bestuderen van hoe kankertherapieën de baarmoeder kunnen beïnvloeden, kan het bijvoorbeeld moeilijk zijn om te onderscheiden of een waargenomen baarmoederfenotype (zoals zwangerschapsverlies of menstruatieacycliciteit) het gevolg is van een directe belediging van de baarmoeder of een gevolgeffect van schade aan de eierstokken.
Om de vruchtbaarheid volledig te begrijpen, moeten de baarmoederbijdragen aan de zwangerschap worden gekarakteriseerd. Belangrijk is dat dit begrip verder moet reiken dan de baarmoederfunctie onder ovariële controle. Dit kan niet bij mensen worden bestudeerd; Daarom worden vaak diermodellen gebruikt. Als zodanig wordt ovariëctomie (OVX) vaak gebruikt om onderzoekers in staat te stellen knaagdieroestruscycli te reguleren (analoog aan de menstruatiecyclus) door exogene hormonen te leveren. Bovendien maakt OVX het mogelijk om baarmoederresponsen te bestuderen onafhankelijk van ovariële invloed12. Als hormonen echter niet onmiddellijk na OVX worden geleverd, zal een menopauzefenotype optreden, dat zorgvuldig door de onderzoekers moet worden overwogen.
OVX wordt vaak gebruikt in knaagdiermodellen 13,14,15,16,17 en is relatief eenvoudig uit te voeren na adequate training. Methoden variëren afhankelijk van of de eierstok alleen of de eierstok en eileider worden verwijderd, evenals afhankelijk van de leeftijd van het dier (volwassen, fietsende dieren hebben grotere eierstokken met een zichtbaar corpus luteum op hun oppervlak, wat betekent dat hun eierstokken gemakkelijker te visualiseren zijn). Evenzo bestaan er veel methoden voor hormoonsuppletie, waaronder subcutane injecties14, pellets met langzame afgifte15, osmotische minipompen18 en ovariële transplantatie.
In dit artikel worden gedetailleerde instructies gegeven over het uitvoeren van ovariëctomie en het bereiden van drie soorten hormoonsuppletie, waaronder subcutane injecties, pellets met langzame afgifte en osmotische minipompen. Er worden twee gedetailleerde protocollen verstrekt voor experimentele eindpunten die baat hebben bij OVX, gevolgd door exogene hormoonsuppletie (embryotransfer en kunstmatige decidualisatie). Dit artikel bespreekt de sterke en zwakke punten van elke aanpak met als doel onderzoekers te begeleiden bij het uitvoeren van studies om de effecten op de baarmoeder te isoleren, met name op het gebied van zwangerschap en vruchtbaarheid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel biedt stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van OVX en biedt exogene hormonen voor studies gericht op het begrijpen van de baarmoederbijdragen aan zwangerschap en vruchtbaarheid. Er worden twee gedetailleerde protocollen verstrekt over twee experimentele toepassingen van deze methoden, waaronder het uitvoeren van embryotransfer en het kunstmatig induceren van decidualisatie.
Hoewel het uitvoeren van OVX in eerste instantie een uitdaging kan zijn – vooral voor onderzoekers die…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd mogelijk gemaakt door de Victorian State Government Operational Infrastructure Support en de Australian Government National Health and Medical Research Council (NHMRC) IRIISS. Dit werk werd ondersteund door de Monash University Faculty of Medicine, Nursing and Health Science Platform Access Grant aan A.L.W. (Winship-PAG18-0343) om toegang te krijgen tot het Monash Reproductive Services Platform. A.L.W. wordt ondersteund door DECRA-financiering DE21010037 van de Australian Research Council (ARC). J.N.H. en L.R.A. worden ondersteund door een Australian Government Research Training Program Scholarship. L.R.A. wordt ondersteund door een Monash Graduate Excellence Scholarship. K.J.H. wordt ondersteund door een ARC Future Fellowship FT190100265.
Materials
| ALZET 1002 mini osmotic pumps | BioScientifica | 1002 | Delivers 0.25 µL/h for 14 days. Use for section 7 (Experimental procedure – Embryo transfer). |
| ALZET 1003D mini osmotic pumps | BioScientifica | 1003D | Delivers 1 µL/h for 14 days. Use for section 8 (Experimental procedure – Artificial decidualization). |
| ALZET Reflex 7 mm clips | BioScientifica | 0009971 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| ALZET Reflex clip applicator | BioScientifica | 0009974 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| ALZET Reflex clip remover | BioScientifica | 0009976 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| Bupivicaine injection | Pfizer | NA | Stock 0.5%. Use at 0.05% in saline |
| Estradiol | Sigma | E8875 | |
| Meloxicam | Ilium | NA | Active constituent 0.5 mg/mL. Use 3.5 mL per 200 mL cage bottle, or as your institutions vet prescribes. |
| Michel clips | Daniels | NS-000242 | |
| Multi purpose sealant | Dow Corning | 732 | |
| Non-surgical embryo transfer (NSET) device | ParaTechs | 60010 | Contains 6 mm speculum. Single use only. |
| Progesterone | Sigma | P0130 | Soluble in ethanol. Use for section 3 (Hormone preparation – subcutaneous injection) and section 4 (Hormone preparation – slow-release pellets) |
| Progesterone | Sigma | P7556 | Soluble in water. Use for section 5 (Hormone preparation – osmotic mini pumps) |
| Refresh eye ointment | Allergan | NA | 42.5% w/v liquid paraffin, 57.3% w/v soft white paraffin |
| Rimadyl Carprofen | Zoetis | NA | Stock 50 mg/mL. Use at 5 mg/kg |
| Rubber tubing | Dow Corning | 508-008 | Washed in 100% ethanol and cut into 1 cm pieces. Inside diameter 1.57 mm ± 0.23 mm; outside diamater 3.18 mm ± 0.23 mm; wall 0.81 mm. |
| Sesame oil | Sigma | S3547 | |
| Sofsilk Silk sutures size 3-0 | Covidien | GS-832 |
References
- Szamatowicz, M. Assisted reproductive technology in reproductive medicine – Possibilities and limitations. Ginekologia Polska. 87 (12), 820-823 (2016).
- Evans, J., et al. Fertile ground: Human endometrial programming and lessons in health and disease. Nature Reviews. Endocrinology. 12 (11), 654-667 (2016).
- Norwitz, E. R., Schust, D. J., Fisher, S. J. Implantation and the survival of early pregnancy. The New England Journal of Medicine. 345 (19), 1400-1408 (2001).
- Zinaman, M. J., Clegg, E. D., Brown, C. C., O’Connor, J., Selevan, S. G. Estimates of human fertility and pregnancy loss. Fertility & Sterility. 65 (3), 503-509 (1996).
- Kupka, M. S., et al. Assisted reproductive technology in Europe, 2010: Results generated from European registers by ESHRE†. Human Reproduction. 29 (10), 2099-2113 (2014).
- Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. Worldwide decline of IVF birth rates and its probable causes. Human Reproduction Open. 2019 (3), (2019).
- Diaz-Gimeno, P., et al. A genomic diagnostic tool for human endometrial receptivity based on the transcriptomic signature. Fertility & Sterility. 95 (1), 50-60 (2011).
- Amin, J., et al. Personalized embryo transfer outcomes in recurrent implantation failure patients following endometrial receptivity array with pre-implantation genetic testing. Cureus. 14 (6), e26248 (2022).
- Patel, J. A., Patel, A. J., Banker, J. M., Shah, S. I., Banker, M. R. Personalized embryo transfer helps in improving in vitro fertilization/ICSI outcomes in patients with recurrent implantation failure. Journal of Human Reproductive Sciences. 12 (1), 59-66 (2019).
- Khan, K. N., et al. Biological differences between functionalis and basalis endometria in women with and without adenomyosis. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 203, 49-55 (2016).
- Richards, J. S., Ren, Y. A., Candelaria, N., Adams, J. E., Rajkovic, A. Ovarian follicular theca cell recruitment, differentiation, and impact on fertility: 2017 update. Endocrine Reviews. 39 (1), 1-20 (2018).
- Corciulo, C., et al. Pulsed administration for physiological estrogen replacement in mice. F1000Research. 10, 809 (2021).
- Greaves, E., et al. A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium. The American Journal of Pathology. 184 (7), 1930-1939 (2014).
- Griffiths, M. J., Alesi, L. R., Winship, A. L., Hutt, K. J. Development of an embryo transfer model to study uterine contributions to pregnancy in vivo in mice. Reproduction & Fertility. 3 (1), 10-18 (2022).
- Cousins, F. L., et al. Evidence from a mouse model that epithelial cell migration and mesenchymal-epithelial transition contribute to rapid restoration of uterine tissue integrity during menstruation. PLoS One. 9 (1), e86378 (2014).
- Cousins, F. L., et al. Androgens regulate scarless repair of the endometrial "wound" in a mouse model of menstruation. FASEB Journal. 30 (8), 2802-2811 (2016).
- Fullerton, P. T., Monsivais, D., Kommagani, R., Matzuk, M. M. Follistatin is critical for mouse uterine receptivity and decidualization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (24), E4772-E4781 (2017).
- Rowland, R. R., Reyes, E., Chukwuocha, R., Tokuda, S. Corticosteroid and immune responses of mice following mini-osmotic pump implantation. Immunopharmacology. 20 (3), 187-190 (1990).
- Barton, B. E., et al. Roles of steroid hormones in oviductal function. Reproduction. 159 (3), R125-R137 (2020).
- Lee, J. E., et al. Autophagy regulates embryonic survival during delayed implantation. Endocrinology. 152 (5), 2067-2075 (2011).
- Hamatani, T., et al. Global gene expression analysis identifies molecular pathways distinguishing blastocyst dormancy and activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (28), 10326-10331 (2004).
- Cui, L., et al. Transcervical embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (3), 228-231 (2014).
