שיטות לחקר תרומות הרחם לביסוס הריון במודל עכבר לכריתת שחלות
Summary
ביסוס הריון הוא תהליך דינמי הכולל הצלבה מורכבת של עוברים ורחם. התרומות המדויקות של סביבת הרחם האימהית לתהליכים אלה נותרו תחום מחקר פעיל. כאן, פרוטוקולים מפורטים מסופקים כדי לסייע בעיצוב מודלים של בעלי חיים in vivo כדי לענות על שאלות מחקר אלה.
Abstract
כדי לבסס הריון, בלסטוציסט בר קיימא חייב לקיים אינטראקציה מוצלחת עם רירית הרחם (רירית הרחם) כדי להקל על ההשתלה והיווצרות השליה ולאפשר הריון מתמשך. המגבלות להצלחת הריון הנגרמות על ידי מומים עובריים ידועות היטב והתגברו במידה רבה בעשורים האחרונים עם עליית הפריה חוץ גופית (IVF) וטכנולוגיות רבייה מסייעות. עם זאת, עד כה, התחום לא התגבר על המגבלות הנגרמות על ידי אנדומטריום שאינו פתוח כראוי, ובכך הביא לקיפאון בשיעורי ההצלחה של הפריה חוץ גופית. תפקודי השחלות ורירית הרחם שלובים זה בזה באופן הדוק, שכן הורמונים המיוצרים על ידי השחלה אחראים למחזוריות הווסת של רירית הרחם. לכן, בעת שימוש במודלים מכרסמים של הריון, זה יכול להיות קשה לקבוע אם תוצאה שנצפתה נובעת מגירעון בשחלות או ברחם. כדי להתגבר על כך, פותח מודל עכבר שחלתי עם החזרת עוברים או דצידואליזציה מלאכותית כדי לאפשר מחקר של תרומות ספציפיות לרחם להריון. מאמר זה יספק הוראות כיצד לבצע כריתת שחלות ויציע תובנות לגבי טכניקות שונות לאספקת הורמונים אקסוגניים לתמיכה בדצידואליזציה מלאכותית מוצלחת או בהריון לאחר החזרת עוברים מתורמים בריאים. טכניקות אלה כוללות הזרקה תת עורית, כדוריות שחרור איטי ומשאבות מיני אוסמוטיות. יידונו היתרונות והחסרונות העיקריים של כל שיטה, המאפשרים לחוקרים לבחור את עיצוב המחקר הטוב ביותר לשאלת המחקר הספציפית שלהם.
Introduction
עם השימוש הגובר בטכנולוגיות רבייה בסיוע בעשורים האחרונים, התגברו על מחסומים רבים להתעברות, המאפשרים לזוגות רבים להקים משפחות למרות בעיות פוריות1. לעתים קרובות ניתן לעקוף ביציות או גירעונות זרע באמצעות הפריה חוץ גופית או הזרקת זרע intracytoplasmic; עם זאת, נושאים הקשורים לרחם וקליטת רירית הרחם נותרו “קופסה שחורה” חמקמקה של פוטנציאל רבייה2.
הריון נוצר כאשר עובר באיכות גבוהה בהצלחה אינטראקציה עם אנדומטריום פתוח (רירית הרחם). הסיכויים להריון מוצלח בכל מחזור חודשי נתון נמוכים, בסביבות 30%3,4. מבין אלה שמצליחים, רק 50%-60% מתקדמים מעבר לשבוע 20 להריון, כאשר כישלון ההשתלה אחראי ל-75% מההריונות שאינם מגיעים לשבוע 203. למרות נתונים אלה מסוף שנות התשעים, התחום עדיין לא התגבר על המגבלות הנגרמות על ידי רירית הרחם שאינה קולטת כראוי. זה הביא לקיפאון – ולפעמים לירידה – בשיעורי ההצלחה של הפריה חוץ גופית בשנים האחרונות 5,6.
לנשים עם אי פוריות בלתי מוסברת יש לעתים קרובות חלון פתוח שנעקר או שאינן מסוגלות להשיג פתיחות מסיבות לא ידועות. לאחרונה פותח מערך קליטת רירית הרחם, המעריך ביטוי של מאות גנים במטרה להתאים את עיתוי החזרת העוברים לחלון הקבלה של הפרט 7,8,9. עם זאת, בתחום עדיין חסרה הבנה של הפתוגנזה של סיבוכי הריון הבאים לידי ביטוי לאחר השלמת תהליך ההשתלה.
מערכת הרבייה הנשית דינמית מאוד ונמצאת תחת בקרה הורמונלית הדוקה. ציר ההיפותלמוס-יותרת המוח-גונדל (HPG) שולט בשחרור הורמון מחלמן והורמון מגרה זקיקים, המווסתים היבטים של מחזור השחלות, כולל הבשלת זקיקים ופעילות אסטרוגן ופרוגסטרון. בתורו, מחזור הווסת הרחם מוסדר על ידי אסטרוגנים ופרוגסטרון10,11. לפיכך, חקר מנגנונים ביולוגיים של הרחם מסובך על ידי השפעה השחלות. לדוגמה, כאשר חוקרים כיצד טיפולים בסרטן עשויים להשפיע על הרחם, זה יכול להיות קשה להבחין אם כל פנוטיפ הרחם שנצפה (כגון אובדן הריון או acyclicity הווסת) הוא תוצאה של עלבון ישיר לרחם או תוצאה של נזק לשחלות.
כדי להבין באופן מקיף את הפוריות, יש לאפיין את תרומת הרחם להריון. חשוב לציין, הבנה זו חייבת להתרחב מעבר לתפקוד הרחם תחת שליטה שחלתית. לא ניתן לחקור זאת בבני אדם; לכן, מודלים של בעלי חיים משמשים לעתים קרובות. ככזה, כריתת שחלות (OVX) משמשת בדרך כלל כדי לאפשר לחוקרים לווסת את מחזורי הייחום של מכרסמים (בדומה למחזור החודשי) על ידי אספקת הורמונים באופן אקסוגני. בנוסף, OVX מאפשר לחקור את תגובות הרחם ללא תלות בהשפעה השחלתית12. עם זאת, אם הורמונים אינם מסופקים באופן מיידי לאחר OVX, פנוטיפ גיל המעבר יהיה בסופו של דבר, אשר צריך להישקל בזהירות על ידי החוקרים.
OVX משמש לעתים קרובות בדגמי מכרסמים 13,14,15,16,17 וקל יחסית לבצע אותו לאחר אימון מתאים. השיטות משתנות בהתאם להסרת השחלה לבדה או השחלה והאובידוקט, כמו גם בהתאם לגיל החיה (לבעלי חיים בוגרים, רוכבי אופניים יש שחלות גדולות יותר עם קורפוס לוטאום גלוי על פני השטח שלהם, כלומר השחלות שלהם קל יותר לדמיין). באופן דומה, קיימות שיטות רבות לתוספי הורמונים, כולל זריקות תת עוריות14, כדורים בשחרור איטי 15, משאבות מיני אוסמוטיות18 והשתלת שחלות.
במאמר זה, הוראות מפורטות ניתנות כיצד לבצע כריתת שחלות ולהכין שלושה סוגים של תוספי הורמונים, כולל זריקות תת עוריות, כדורים בשחרור איטי, משאבות מיני אוסמוטיות. שני פרוטוקולים מפורטים מסופקים עבור נקודות קצה ניסיוניות הנהנות מ- OVX ואחריו תוספת הורמונים אקסוגנית (החזרת עוברים ודצידואליזציה מלאכותית). מאמר זה דן בחוזקות ובחולשות של כל גישה במטרה להנחות חוקרים כיצד לבצע מחקרים לבידוד ההשפעות על הרחם, במיוחד בתחומי המחקר הריון ופוריות.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה מספק הוראות שלב אחר שלב כיצד לבצע OVX ולספק הורמונים אקסוגניים למחקרים המתמקדים בהבנת תרומת הרחם להריון ולפוריות. שני פרוטוקולים מפורטים מסופקים על שני יישומים ניסיוניים של שיטות אלה, כולל ביצוע החזרת עוברים וגרימת דצידואליזציה באופן מלאכותי.
בעוד שביצוע OVX יכול להי…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו התאפשרה באמצעות תמיכת התשתיות התפעוליות של ממשלת מדינת ויקטוריה והמועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי של ממשלת אוסטרליה (NHMRC) IRIISS. עבודה זו נתמכה על ידי הפקולטה לרפואה, סיעוד ומדעי הבריאות באוניברסיטת מונאש מענק גישה ל- A.L.W. (Winship-PAG18-0343) כדי לגשת לפלטפורמת שירותי הרבייה של מונאש. א.ל.ו. נתמכת על ידי DECRA מימון DE21010037 ממועצת המחקר האוסטרלית (ARC). J.N.H. ו- L.R.A. נתמכים על ידי מלגת תוכנית הכשרת המחקר של ממשלת אוסטרליה. L.R.A. נתמכת על ידי מלגת הצטיינות בוגרי מונש. K.J.H. נתמך על ידי ARC Future Fellowship FT190100265.
Materials
| ALZET 1002 mini osmotic pumps | BioScientifica | 1002 | Delivers 0.25 µL/h for 14 days. Use for section 7 (Experimental procedure – Embryo transfer). |
| ALZET 1003D mini osmotic pumps | BioScientifica | 1003D | Delivers 1 µL/h for 14 days. Use for section 8 (Experimental procedure – Artificial decidualization). |
| ALZET Reflex 7 mm clips | BioScientifica | 0009971 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| ALZET Reflex clip applicator | BioScientifica | 0009974 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| ALZET Reflex clip remover | BioScientifica | 0009976 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| Bupivicaine injection | Pfizer | NA | Stock 0.5%. Use at 0.05% in saline |
| Estradiol | Sigma | E8875 | |
| Meloxicam | Ilium | NA | Active constituent 0.5 mg/mL. Use 3.5 mL per 200 mL cage bottle, or as your institutions vet prescribes. |
| Michel clips | Daniels | NS-000242 | |
| Multi purpose sealant | Dow Corning | 732 | |
| Non-surgical embryo transfer (NSET) device | ParaTechs | 60010 | Contains 6 mm speculum. Single use only. |
| Progesterone | Sigma | P0130 | Soluble in ethanol. Use for section 3 (Hormone preparation – subcutaneous injection) and section 4 (Hormone preparation – slow-release pellets) |
| Progesterone | Sigma | P7556 | Soluble in water. Use for section 5 (Hormone preparation – osmotic mini pumps) |
| Refresh eye ointment | Allergan | NA | 42.5% w/v liquid paraffin, 57.3% w/v soft white paraffin |
| Rimadyl Carprofen | Zoetis | NA | Stock 50 mg/mL. Use at 5 mg/kg |
| Rubber tubing | Dow Corning | 508-008 | Washed in 100% ethanol and cut into 1 cm pieces. Inside diameter 1.57 mm ± 0.23 mm; outside diamater 3.18 mm ± 0.23 mm; wall 0.81 mm. |
| Sesame oil | Sigma | S3547 | |
| Sofsilk Silk sutures size 3-0 | Covidien | GS-832 |
References
- Szamatowicz, M. Assisted reproductive technology in reproductive medicine – Possibilities and limitations. Ginekologia Polska. 87 (12), 820-823 (2016).
- Evans, J., et al. Fertile ground: Human endometrial programming and lessons in health and disease. Nature Reviews. Endocrinology. 12 (11), 654-667 (2016).
- Norwitz, E. R., Schust, D. J., Fisher, S. J. Implantation and the survival of early pregnancy. The New England Journal of Medicine. 345 (19), 1400-1408 (2001).
- Zinaman, M. J., Clegg, E. D., Brown, C. C., O’Connor, J., Selevan, S. G. Estimates of human fertility and pregnancy loss. Fertility & Sterility. 65 (3), 503-509 (1996).
- Kupka, M. S., et al. Assisted reproductive technology in Europe, 2010: Results generated from European registers by ESHRE†. Human Reproduction. 29 (10), 2099-2113 (2014).
- Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. Worldwide decline of IVF birth rates and its probable causes. Human Reproduction Open. 2019 (3), (2019).
- Diaz-Gimeno, P., et al. A genomic diagnostic tool for human endometrial receptivity based on the transcriptomic signature. Fertility & Sterility. 95 (1), 50-60 (2011).
- Amin, J., et al. Personalized embryo transfer outcomes in recurrent implantation failure patients following endometrial receptivity array with pre-implantation genetic testing. Cureus. 14 (6), e26248 (2022).
- Patel, J. A., Patel, A. J., Banker, J. M., Shah, S. I., Banker, M. R. Personalized embryo transfer helps in improving in vitro fertilization/ICSI outcomes in patients with recurrent implantation failure. Journal of Human Reproductive Sciences. 12 (1), 59-66 (2019).
- Khan, K. N., et al. Biological differences between functionalis and basalis endometria in women with and without adenomyosis. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 203, 49-55 (2016).
- Richards, J. S., Ren, Y. A., Candelaria, N., Adams, J. E., Rajkovic, A. Ovarian follicular theca cell recruitment, differentiation, and impact on fertility: 2017 update. Endocrine Reviews. 39 (1), 1-20 (2018).
- Corciulo, C., et al. Pulsed administration for physiological estrogen replacement in mice. F1000Research. 10, 809 (2021).
- Greaves, E., et al. A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium. The American Journal of Pathology. 184 (7), 1930-1939 (2014).
- Griffiths, M. J., Alesi, L. R., Winship, A. L., Hutt, K. J. Development of an embryo transfer model to study uterine contributions to pregnancy in vivo in mice. Reproduction & Fertility. 3 (1), 10-18 (2022).
- Cousins, F. L., et al. Evidence from a mouse model that epithelial cell migration and mesenchymal-epithelial transition contribute to rapid restoration of uterine tissue integrity during menstruation. PLoS One. 9 (1), e86378 (2014).
- Cousins, F. L., et al. Androgens regulate scarless repair of the endometrial "wound" in a mouse model of menstruation. FASEB Journal. 30 (8), 2802-2811 (2016).
- Fullerton, P. T., Monsivais, D., Kommagani, R., Matzuk, M. M. Follistatin is critical for mouse uterine receptivity and decidualization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (24), E4772-E4781 (2017).
- Rowland, R. R., Reyes, E., Chukwuocha, R., Tokuda, S. Corticosteroid and immune responses of mice following mini-osmotic pump implantation. Immunopharmacology. 20 (3), 187-190 (1990).
- Barton, B. E., et al. Roles of steroid hormones in oviductal function. Reproduction. 159 (3), R125-R137 (2020).
- Lee, J. E., et al. Autophagy regulates embryonic survival during delayed implantation. Endocrinology. 152 (5), 2067-2075 (2011).
- Hamatani, T., et al. Global gene expression analysis identifies molecular pathways distinguishing blastocyst dormancy and activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (28), 10326-10331 (2004).
- Cui, L., et al. Transcervical embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (3), 228-231 (2014).
