طرق دراسة مساهمات الرحم في تأسيس الحمل في نموذج فأر استئصال المبيض
Summary
تأسيس الحمل هو عملية ديناميكية تنطوي على تداخل معقد بين الجنين والرحم. ولا تزال المساهمات الدقيقة لبيئة رحم الأم في هذه العمليات مجالا نشطا للتحقيق. هنا ، يتم توفير بروتوكولات مفصلة للمساعدة في تصميم نماذج حيوانية في الجسم الحي لمعالجة هذه الأسئلة البحثية.
Abstract
لإثبات الحمل، يجب أن تتفاعل الكيسة الأريمية القابلة للحياة بنجاح مع بطانة الرحم المستقبلة (بطانة الرحم) لتسهيل الزرع وتكوين المشيمة وتمكين الحمل المستمر. إن القيود المفروضة على نجاح الحمل الناجمة عن العيوب الجنينية معروفة جيدا وقد تم التغلب عليها إلى حد كبير في العقود الأخيرة مع ظهور الإخصاب في المختبر (IVF) وتقنيات الإنجاب المساعدة. ومع ذلك ، حتى الآن ، لم يتغلب المجال على القيود الناجمة عن بطانة الرحم غير المتقبلة بشكل كاف ، مما أدى إلى ركود معدلات نجاح التلقيح الاصطناعي. تتشابك وظائف المبيض وبطانة الرحم بشكل وثيق ، حيث أن الهرمونات التي ينتجها المبيض هي المسؤولة عن الدورة الشهرية في بطانة الرحم. على هذا النحو ، عند استخدام نماذج القوارض للحمل ، قد يكون من الصعب التأكد مما إذا كانت النتيجة الملحوظة ناتجة عن عجز المبيض أو الرحم. للتغلب على هذا ، تم تطوير نموذج فأر استئصال المبيض مع نقل الأجنة أو إزالة الترسيب الاصطناعي للسماح بدراسة المساهمات الخاصة بالرحم في الحمل. ستوفر هذه المقالة إرشادات حول كيفية إجراء استئصال المبيض وتقدم رؤى حول التقنيات المختلفة لتزويد الهرمونات الخارجية لدعم عملية إزالة الترسبات الاصطناعية الناجحة أو الحمل بعد نقل الأجنة من متبرعين أصحاء. وتشمل هذه التقنيات الحقن تحت الجلد ، والكريات بطيئة الإطلاق ، والمضخات الصغيرة التناضحية. ستتم مناقشة المزايا والعيوب الرئيسية لكل طريقة ، مما يمكن الباحثين من اختيار أفضل تصميم دراسة لسؤالهم البحثي المحدد.
Introduction
مع الاستخدام المتزايد للتقنيات الإنجابية المساعدة في العقود الأخيرة ، تم التغلب على العديد من الحواجز التي تحول دون الحمل ، مما سمح للعديد من الأزواج بتكوين أسر على الرغم من مشاكل الخصوبة1. غالبا ما يمكن تجاوز عجز البويضات أو الحيوانات المنوية باستخدام الإخصاب في المختبر أو حقن الحيوانات المنوية داخل الهيولي. ومع ذلك ، تظل القضايا المتعلقة بالرحم وتقبل بطانة الرحم “صندوقا أسود” بعيد المنال للإمكانات الإنجابية2.
يتم تأسيس الحمل عندما يتفاعل الجنين عالي الجودة بنجاح مع بطانة الرحم المستقبلة (بطانة الرحم). فرص نجاح الحمل في أي دورة شهرية منخفضة ، عند حوالي 30٪ 3,4. من بين تلك التي نجحت ، يتقدم 50٪ -60٪ فقط بعد 20 أسبوعا من الحمل ، مع فشل الزرع المسؤول عن 75٪ من حالات الحمل التي لا تصل إلى 20 أسبوعا3. على الرغم من هذه الأرقام التي يعود تاريخها إلى أواخر تسعينيات القرن العشرين ، فإن المجال لم يتغلب بعد على القيود الناجمة عن بطانة الرحم غير المتقبلة بشكل كاف. وقد أدى ذلك إلى ركود – وأحيانا انخفاض – معدلات نجاح التلقيح الاصطناعي في السنوات الأخيرة 5,6.
غالبا ما يكون لدى النساء المصابات بالعقم غير المبرر نافذة نازحة من التقبل أو غير قادرات على تحقيق التقبل لأسباب غير معروفة. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير مجموعة تقبل بطانة الرحم ، والتي تقيم التعبير عن مئات الجينات بهدف تكييف توقيت نقل الأجنة مع نافذة تقبل الفرد7،8،9. ومع ذلك ، لا يزال الحقل يفتقر إلى فهم التسبب في مضاعفات الحمل التي تظهر بعد اكتمال عملية الزرع.
الجهاز التناسلي للأنثى ديناميكي للغاية ويخضع لرقابة هرمونية مشددة. يتحكم محور ما تحت المهاد والغدة النخامية والغدد التناسلية (HPG) في إفراز الهرمون اللوتيني والهرمون المنبه للجريب ، والذي ينظم جوانب دورة المبيض ، بما في ذلك نضوج الجريب ونشاط الإستروجين والبروجسترون. في المقابل ، يتم تنظيم الدورة الشهرية الرحمية عن طريق هرمون الاستروجين والبروجستيرون10,11. وبالتالي ، فإن دراسة الآليات البيولوجية الرحمية معقدة بسبب تأثير المبيض. على سبيل المثال ، عند دراسة كيفية تأثير علاجات السرطان على الرحم ، قد يكون من الصعب التمييز بين ما إذا كان أي نمط ظاهري للرحم لوحظ (مثل فقدان الحمل أو عدم حدة الحيض) هو نتيجة لإهانة مباشرة للرحم أو تأثير تبعي من تلف المبايض.
لفهم الخصوبة بشكل شامل ، يجب تمييز مساهمات الرحم في الحمل. الأهم من ذلك ، يجب أن يمتد هذا الفهم إلى ما وراء وظيفة الرحم تحت سيطرة المبيض. هذا لا يمكن دراسته في البشر. لذلك ، غالبا ما يتم استخدام النماذج الحيوانية. على هذا النحو ، يستخدم استئصال المبيض (OVX) بشكل شائع لتمكين الباحثين من تنظيم دورات القوارض الشحمية (مماثلة لدورة الحيض) عن طريق توفير الهرمونات خارجيا. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح OVX بدراسة استجابات الرحم بشكل مستقل عن تأثير المبيض12. ومع ذلك ، إذا لم يتم توفير الهرمونات على الفور بعد OVX ، فسوف يحدث النمط الظاهري لانقطاع الطمث ، والذي يحتاج إلى دراسة بعناية من قبل الباحثين.
كثيرا ما يستخدم OVX في نماذج القوارض13،14،15،16،17 ومن السهل نسبيا القيام به بعد التدريب الكافي. تختلف الطرق اعتمادا على ما إذا كان المبيض وحده أو المبيض وقناة البيض ، وكذلك اعتمادا على عمر الحيوان (الحيوانات البالغة ، التي يتم ركوب الدراجات لها مبايض أكبر مع جسم أصفر مرئي على سطحها ، مما يعني أن المبايض أسهل في التصور). وبالمثل ، توجد العديد من طرق التكميل الهرموني ، بما في ذلك الحقن تحت الجلد14 ، والكريات بطيئة الإطلاق 15 ، والمضخات الصغيرة التناضحية18 ، وتطعيم المبيض.
في هذه المقالة ، يتم توفير تعليمات مفصلة حول كيفية إجراء استئصال المبيض وإعداد ثلاثة أنواع من مكملات الهرمونات ، بما في ذلك الحقن تحت الجلد ، والكريات بطيئة الإطلاق ، والمضخات الصغيرة التناضحية. يتم توفير بروتوكولين مفصلين لنقاط النهاية التجريبية التي تستفيد من OVX تليها مكملات الهرمونات الخارجية (نقل الأجنة وإزالة الترسيب الاصطناعي). تناقش هذه المقالة نقاط القوة والضعف في كل نهج بهدف توجيه الباحثين فيما يتعلق بكيفية إجراء دراسات لعزل التأثيرات على الرحم ، وتحديدا في مجالات أبحاث الحمل والخصوبة.
Protocol
Representative Results
Discussion
توفر هذه المقالة إرشادات خطوة بخطوة حول كيفية إجراء OVX وتوفير هرمونات خارجية للدراسات التي تركز على فهم مساهمات الرحم في الحمل والخصوبة. يتم توفير بروتوكولين مفصلين حول تطبيقين تجريبيين لهذه الطرق ، بما في ذلك إجراء نقل الأجنة وتحفيز إزالة الترسبات بشكل مصطنع.
في حين أن إجر…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أصبح هذا العمل ممكنا من خلال دعم البنية التحتية التشغيلية لحكومة ولاية فيكتوريا والمجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية التابع للحكومة الأسترالية (NHMRC) IRIISS. تم دعم هذا العمل من قبل منحة الوصول إلى كلية الطب والتمريض والعلوم الصحية بجامعة موناش إلى A.L.W. (Winship-PAG18-0343) للوصول إلى منصة موناش للخدمات الإنجابية. يتم دعم A.L.W. بتمويل DECRA DE21010037 من مجلس البحوث الأسترالي (ARC). يتم دعم JNH و LRA من خلال منحة برنامج التدريب البحثي للحكومة الأسترالية. يتم دعم LRA من خلال منحة موناش للتميز في الدراسات العليا. يتم دعم KJH من قبل زمالة ARC المستقبلية FT190100265.
Materials
| ALZET 1002 mini osmotic pumps | BioScientifica | 1002 | Delivers 0.25 µL/h for 14 days. Use for section 7 (Experimental procedure – Embryo transfer). |
| ALZET 1003D mini osmotic pumps | BioScientifica | 1003D | Delivers 1 µL/h for 14 days. Use for section 8 (Experimental procedure – Artificial decidualization). |
| ALZET Reflex 7 mm clips | BioScientifica | 0009971 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| ALZET Reflex clip applicator | BioScientifica | 0009974 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| ALZET Reflex clip remover | BioScientifica | 0009976 | Either Reflex clips or Michel clips can be used for wound closure, depending on preference |
| Bupivicaine injection | Pfizer | NA | Stock 0.5%. Use at 0.05% in saline |
| Estradiol | Sigma | E8875 | |
| Meloxicam | Ilium | NA | Active constituent 0.5 mg/mL. Use 3.5 mL per 200 mL cage bottle, or as your institutions vet prescribes. |
| Michel clips | Daniels | NS-000242 | |
| Multi purpose sealant | Dow Corning | 732 | |
| Non-surgical embryo transfer (NSET) device | ParaTechs | 60010 | Contains 6 mm speculum. Single use only. |
| Progesterone | Sigma | P0130 | Soluble in ethanol. Use for section 3 (Hormone preparation – subcutaneous injection) and section 4 (Hormone preparation – slow-release pellets) |
| Progesterone | Sigma | P7556 | Soluble in water. Use for section 5 (Hormone preparation – osmotic mini pumps) |
| Refresh eye ointment | Allergan | NA | 42.5% w/v liquid paraffin, 57.3% w/v soft white paraffin |
| Rimadyl Carprofen | Zoetis | NA | Stock 50 mg/mL. Use at 5 mg/kg |
| Rubber tubing | Dow Corning | 508-008 | Washed in 100% ethanol and cut into 1 cm pieces. Inside diameter 1.57 mm ± 0.23 mm; outside diamater 3.18 mm ± 0.23 mm; wall 0.81 mm. |
| Sesame oil | Sigma | S3547 | |
| Sofsilk Silk sutures size 3-0 | Covidien | GS-832 |
References
- Szamatowicz, M. Assisted reproductive technology in reproductive medicine – Possibilities and limitations. Ginekologia Polska. 87 (12), 820-823 (2016).
- Evans, J., et al. Fertile ground: Human endometrial programming and lessons in health and disease. Nature Reviews. Endocrinology. 12 (11), 654-667 (2016).
- Norwitz, E. R., Schust, D. J., Fisher, S. J. Implantation and the survival of early pregnancy. The New England Journal of Medicine. 345 (19), 1400-1408 (2001).
- Zinaman, M. J., Clegg, E. D., Brown, C. C., O’Connor, J., Selevan, S. G. Estimates of human fertility and pregnancy loss. Fertility & Sterility. 65 (3), 503-509 (1996).
- Kupka, M. S., et al. Assisted reproductive technology in Europe, 2010: Results generated from European registers by ESHRE†. Human Reproduction. 29 (10), 2099-2113 (2014).
- Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. Worldwide decline of IVF birth rates and its probable causes. Human Reproduction Open. 2019 (3), (2019).
- Diaz-Gimeno, P., et al. A genomic diagnostic tool for human endometrial receptivity based on the transcriptomic signature. Fertility & Sterility. 95 (1), 50-60 (2011).
- Amin, J., et al. Personalized embryo transfer outcomes in recurrent implantation failure patients following endometrial receptivity array with pre-implantation genetic testing. Cureus. 14 (6), e26248 (2022).
- Patel, J. A., Patel, A. J., Banker, J. M., Shah, S. I., Banker, M. R. Personalized embryo transfer helps in improving in vitro fertilization/ICSI outcomes in patients with recurrent implantation failure. Journal of Human Reproductive Sciences. 12 (1), 59-66 (2019).
- Khan, K. N., et al. Biological differences between functionalis and basalis endometria in women with and without adenomyosis. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 203, 49-55 (2016).
- Richards, J. S., Ren, Y. A., Candelaria, N., Adams, J. E., Rajkovic, A. Ovarian follicular theca cell recruitment, differentiation, and impact on fertility: 2017 update. Endocrine Reviews. 39 (1), 1-20 (2018).
- Corciulo, C., et al. Pulsed administration for physiological estrogen replacement in mice. F1000Research. 10, 809 (2021).
- Greaves, E., et al. A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium. The American Journal of Pathology. 184 (7), 1930-1939 (2014).
- Griffiths, M. J., Alesi, L. R., Winship, A. L., Hutt, K. J. Development of an embryo transfer model to study uterine contributions to pregnancy in vivo in mice. Reproduction & Fertility. 3 (1), 10-18 (2022).
- Cousins, F. L., et al. Evidence from a mouse model that epithelial cell migration and mesenchymal-epithelial transition contribute to rapid restoration of uterine tissue integrity during menstruation. PLoS One. 9 (1), e86378 (2014).
- Cousins, F. L., et al. Androgens regulate scarless repair of the endometrial "wound" in a mouse model of menstruation. FASEB Journal. 30 (8), 2802-2811 (2016).
- Fullerton, P. T., Monsivais, D., Kommagani, R., Matzuk, M. M. Follistatin is critical for mouse uterine receptivity and decidualization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (24), E4772-E4781 (2017).
- Rowland, R. R., Reyes, E., Chukwuocha, R., Tokuda, S. Corticosteroid and immune responses of mice following mini-osmotic pump implantation. Immunopharmacology. 20 (3), 187-190 (1990).
- Barton, B. E., et al. Roles of steroid hormones in oviductal function. Reproduction. 159 (3), R125-R137 (2020).
- Lee, J. E., et al. Autophagy regulates embryonic survival during delayed implantation. Endocrinology. 152 (5), 2067-2075 (2011).
- Hamatani, T., et al. Global gene expression analysis identifies molecular pathways distinguishing blastocyst dormancy and activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (28), 10326-10331 (2004).
- Cui, L., et al. Transcervical embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (3), 228-231 (2014).
