IL-33 ile Uyarılmış Makrofajların, İdiyopatik Pulmoner Fibroz Üzerindeki Etkilerini In Vivo Olarak İncelemek için Bleomisin Kaynaklı Fare Modellerine Evlat Edinilmesi
Summary
Bu protokol, pulmoner interstisyel makrofajların (IM) izolasyonunu ve bir fare modelinde akciğer alveollerinin IL-33 stimülasyonundan sonra evlat edinilen transferlerini tanımlar ve bu da idiyopatik pulmoner fibrozun (İPF) in vivo çalışmasını kolaylaştırabilir.
Abstract
Erken akciğer hasarının neden olduğu enflamatuar yanıt, makrofajlar ve nötrofiller gibi enflamatuar hücrelerin aktivasyonunun yanı sıra TNF-α, IL-1β ve IL-6 gibi enflamatuar faktörlerin salınımının eşlik ettiği idiyopatik pulmoner fibroz (İPF) gelişiminin önemli nedenlerinden biridir. IL-33 stimülasyonuna yanıt olarak aktive pulmoner interstisyel makrofajların (IM) neden olduğu erken inflamasyonun İPF’nin patolojik sürecinde hayati bir rol oynadığı bilinmektedir. Bu protokol, IL-33 tarafından uyarılan IM’lerin İPF gelişimini incelemek için farelerin akciğerlerine evlat edinilmesini açıklamaktadır. Birincil IM’lerin konakçı fare akciğerlerinden izolasyonunu ve kültürünü, ardından uyarılmış IM’lerin bleomisin (BLM) ile indüklenen IPF alıcı farelerin (daha önce klodronat lipozomlarla tedavi edilerek alveoler makrofajların tükenmiş olan) alveollerine evlat edinilmesini ve bu farelerin patolojik değerlendirmesini içerir. Temsili sonuçlar, IL-33 ile uyarılmış makrofajların evlat edinilerek transferinin farelerde pulmoner fibrozisi şiddetlendirdiğini ve makrofaj evlat edinme transfer deneyinin kurulmasının İPF patolojisini incelemek için iyi bir teknik araç olduğunu göstermektedir.
Introduction
İdiyopatik pulmoner fibrozis (İPF), birçok faktörün neden olduğu yaygın pulmoner inflamatuar bir hastalıktır1. Th1 ve Th2 immün yanıtının sitokin mikroortamında, makrofajlar klasik olarak aktive edilmiş makrofajlara (M1) ve alternatif olarak aktive edilmiş makrofajlara (M2) polarize edilebilir. Lipopolisakkaritler (LPS) veya sitokin IFN-γ, M1 makrofajlarını polarize etmeye ve iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α ve IL-12 dahil olmak üzere pro-inflamatuar sitokinler üretmeye indükler. Buna karşılık, tip II sitokinler IL-4 ve IL-13, pulmoner fibroz2’yi destekleyen TGF-β ve PDGF gibi farklı fibroblast büyümesini teşvik eden faktörler üretebilen M2 makrofajlarının polarizasyonunu yönlendirir. İPF’nin patolojik sürecine makrofaj aktivasyonu ve infiltrasyonu eşlik eder. İPF, sitokinlerin salınımı yoluyla yaralanma onarımı, inflamasyon ve fibrozise aracılık eder3. Sadece sınırlı tedavi seçenekleri mevcut olduğundan, İPF’nin moleküler patolojik mekanizmalarının araştırılması, İPF’nin önlenmesi ve tedavisi için yeni stratejilerin geliştirilmesinde büyük önem taşımaktadır. Grubumuz ve diğer araştırmacılar tarafından yapılan önceki çalışmalar 4,5, İPF hastalarında ve bleomisin (BLM) ile indüklenen İPF’li fare modellerinde IL-33’ün salınımının arttığını doğrulamıştır. IL-33, fibroz sırasında epitel ve endotel hücreleri tarafından salınır ve makrofaj aktivasyonunda rol oynar, bu da fibroblastların anormal proliferasyonu, lökosit infiltrasyonu ve nihayetinde akciğer fonksiyon kaybına neden olur5. Mevcut protokol, IL-33 ile uyarılmış interstisyel makrofajların (IM’ler) fare modellerinde İPF gelişimini incelemek için bir araç olarak alveollere evlat edinilmesini tanımlamaktadır. Burada, IM’ler konakçı farelerin akciğer dokusundan izole edildi, in vitro kültüre alındı, 24 saat boyunca IL-33 ile uyarıldı ve daha sonra trakeal enjeksiyon yoluyla alıcı farelerin alveollerine evlat edinildi. Uyarılmış fare makrofajlarının doğrudan toplanması ve alıcı alveollere evlat edinilerek aktarılmasının pulmoner fibrozis derecesini ağırlaştırdığı ve uyarıcı faktörlerin fibroz üzerindeki etkisini önceki çalışmalara kıyasla daha net bir şekilde gösterebildiği bulunmuştur6. Bu makalede açıklanan teknik, araştırmacıların İPF’nin gelişiminde potansiyel sitokinler tarafından uyarılan makrofajların işlevini keşfetmelerini sağlayabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışma, farelerde pulmoner fibroz mekanizmalarını incelemede yardımcı olabilecek makrofajları tüketmek, izole etmek, kültürlemek ve aktarmak için etkili bir yöntem sunmaktadır. Fare makrofaj tükenmesi için trakea uygulaması, kuyruk damarı enjeksiyonu ve burun inhalasyonu gibi birçok yöntem vardır11. Bu çalışma, kullanımı kolay olan ve pulmoner makrofajları etkili bir şekilde tüketebilen nazal inhalasyon yöntemini optimize etmiştir 8,9…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Jiangnan Üniversitesi Laboratuvar Yönetimi Özel Konusunu kabul etmektedir: Patolojik Örneklere Dayalı Dijital Dilim Kütüphanesinin Yapımı (JDSYS202223) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81800065).
Materials
| DMEM | Life technologies Biotechnology,USA | 1508012 | |
| Arterial indwelling needle | B Braun Melsingen AG,Germany | 21G15G8393 | |
| BD Accuri C6 Plus | Becton Dickinson,USA | ||
| Bleomycin | Biotang, USA | Ab9465 | |
| Carbon dioxide incubator | Thermo Forma, USA | Thermo Forma370 | |
| CD11b | R&D Systems,USA | 1124F | |
| CD11c | R&D Systems,USA | N418 | |
| Cell culture dish | Thermo Forma, USA | 174926 | |
| Clodronate liposomes | Clodronate liposomes,Netherlands | CI-150-150 | |
| Collagenase A | Sigma-Aldrich, USA | 10103578001 | |
| F4/80 | R&D Systems,USA | 521204 | |
| Falcon Cell Strainer | Becton,Dickinson and Company, USA | 352340 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies,USA | 1047571 | |
| Hematoxylin Eosin | Nanjing Jiancheng Technology,China | 06-570 | |
| LightCycler 480 PCR detection system | Roche, USA | ||
| Murine recombinant factor IL-33 | Peprotech, USA | 210-33 | |
| Nikon microscope | Nikon Corporation, Japan | 941185 | |
| Penicillin, streptomycin | Life technologies,USA | 877113 | |
| Phosphate buffer (PBS) | Guangdong Huankai Microbial Technology ,China | 1535882 | |
| RBC lysis buffer | Beyotime Biotechnology Company,China | C3702 | |
| RNA Isolater | Vazyme company,China | R401-01-AA | Total RNA extraction reagent |
| RWD Inhalation Anesthesia Machine | Shenzhen Rayward Life Technology ,China | R500 | |
| Semi-automatic paraffin slicer | Leica, Germany | LeicaRM2245 | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara, Japan | 410800 | |
| Trypsin 0.25% | Life Technologies, USA | 1627172 |
References
- Heukels, P., Moor, C. C., vonder Thüsen, J. H., Wijsenbeek, M. S., Kool, M. Inflammation and immunity in IPF pathogenesis and treatment. Respiratory Medicine. 147, 79-91 (2019).
- Zhang, Y., Zhang, Y., Li, X., Zhang, M., Lv, J. Microarray analysis of circular RNA expression patterns in polarized macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 39 (2), 373-379 (2017).
- Lee, J. W., et al. The role of macrophages in the development of acute and chronic inflammatory lung diseases. Cells. 10 (4), 897 (2021).
- Luzina, I. G., et al. Interleukin-33 potentiates bleomycin-induced lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (6), 999-1008 (2013).
- Nie, Y., et al. AKT2 regulates pulmonary inflammation and fibrosis via modulating macrophage activation. Journal of Immunology. 198 (11), 4470-4480 (2017).
- Qian, F., et al. The transcription factor PU.1 promotes alternative macrophage polarization and asthmatic airway inflammation. Journal of Molecular Cell Biology. 7 (6), 557-567 (2015).
- Shah, S., Dhawan, V., Holm, R., Nagarsenker, M. S., Perrie, Y. Liposomes: Advancements and innovation in the manufacturing process. Advanced Drug Delivery Reviews. 154 (155), 102-122 (2020).
- He, W., et al. Alveolar macrophages are critical for broadly-reactive antibody-mediated protection against influenza A virus in mice. Nature Communications. 8 (1), 846 (2017).
- Eyal, F. G., Hamm, C. R., Parker, J. C. Reduction in alveolar macrophages attenuates acute ventilator induced lung injury in rats. Intensive Care Medicine. 33 (7), 1212-1218 (2007).
- Hübner, R. H., et al. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples. Biotechniques. 44 (4), 507-517 (2008).
- Tacke, F., et al. Immature monocytes acquire antigens from other cells in the bone marrow and present them to T cells after maturing in the periphery. The Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 583-597 (2006).
- Byrne, A. J., Maher, T. M., Lloyd, C. M. Pulmonary macrophages: A new therapeutic pathway in fibrosing lung disease. Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 303-316 (2016).
- Wendisch, D., et al. SARS-CoV-2 infection triggers profibrotic macrophage responses and lung fibrosis. Cell. 184 (26), 6243-6261 (2021).
- Zhang, L., et al. Macrophages: Friend or foe in idiopathic pulmonary fibrosis. Respiratory Research. 19 (1), 170 (2018).
