Trasferimento adottivo di macrofagi stimolati da IL-33 in modelli murini indotti da bleomicina per studiare il loro effetto sulla fibrosi polmonare idiopatica in vivo
Summary
Questo protocollo descrive l’isolamento dei macrofagi interstiziali polmonari (IM) e il loro trasferimento adottivo dopo stimolazione IL-33 degli alveoli polmonari in un modello murino, che può facilitare lo studio in vivo della fibrosi polmonare idiopatica (IPF).
Abstract
La risposta infiammatoria causata da lesioni polmonari precoci è una delle cause importanti dello sviluppo della fibrosi polmonare idiopatica (IPF), che è accompagnata dall’attivazione di cellule infiammatorie come macrofagi e neutrofili, nonché dal rilascio di fattori infiammatori tra cui TNF-α, IL-1β e IL-6. È noto che l’infiammazione precoce causata dall’attivazione dei macrofagi interstiziali polmonari (IM) in risposta alla stimolazione di IL-33 svolge un ruolo vitale nel processo patologico dell’IPF. Questo protocollo descrive il trasferimento adottivo di IMs stimolati da IL-33 nei polmoni dei topi per studiare lo sviluppo dell’IPF. Coinvolge l’isolamento e la coltura di IM primari dai polmoni del topo ospite, seguito dal trasferimento adottivo di IM stimolati negli alveoli di topi riceventi IPF indotti da bleomicina (BLM) (che sono stati precedentemente impoveriti di macrofagi alveolari dal trattamento con liposomi clodronati) e la valutazione patologica di quei topi. I risultati rappresentativi mostrano che il trasferimento adottivo di macrofagi stimolati da IL-33 aggrava la fibrosi polmonare nei topi, suggerendo che l’istituzione dell’esperimento di trasferimento adottivo dei macrofagi è un buon mezzo tecnico per studiare la patologia dell’IPF.
Introduction
La fibrosi polmonare idiopatica (IPF) è una malattia infiammatoria polmonare diffusa causata da molti fattori1. Nel microambiente delle citochine della risposta immunitaria Th1 e Th2, i macrofagi possono essere polarizzati in macrofagi classicamente attivati (M1) e alternativamente attivati macrofagi (M2). I lipopolisaccaridi (LPS) o la citochina IFN- γ inducono i macrofagi M1 a polarizzarsi e produrre citochine pro-infiammatorie, tra cui iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α e IL-12. Al contrario, le citochine di tipo II IL-4 e IL-13 guidano la polarizzazione dei macrofagi M2, che possono produrre diversi fattori promotori della crescita dei fibroblasti, come TGF-β e PDGF, che promuovono la fibrosi polmonare2. Il processo patologico dell’IPF è accompagnato dall’attivazione e dall’infiltrazione dei macrofagi. L’IPF media la riparazione delle lesioni, l’infiammazione e la fibrosi attraverso il rilascio di citochine3. Poiché sono disponibili solo opzioni terapeutiche limitate, l’esplorazione dei meccanismi patologici molecolari dell’IPF ha un grande significato per lo sviluppo di nuove strategie per la prevenzione e il trattamento dell’IPF. Precedenti studi del nostro gruppo e di altri ricercatori 4,5 hanno confermato l’aumento del rilascio di IL-33 nei pazienti con IPF e in modelli murini con IPF indotta da bleomicina (BLM). IL-33 viene rilasciato dalle cellule epiteliali ed endoteliali durante la fibrosi ed è coinvolto nell’attivazione dei macrofagi, con conseguente proliferazione anormale dei fibroblasti, infiltrazione leucocitaria e l’eventuale perdita della funzione polmonare5. L’attuale protocollo descrive il trasferimento adottivo di macrofagi interstiziali stimolati da IL-33 (IM) negli alveoli come mezzo per studiare lo sviluppo dell’IPF in modelli murini. Qui, gli IM sono stati isolati dal tessuto polmonare dei topi ospiti, coltivati in vitro, stimolati con IL-33 per 24 ore e quindi trasferiti adottivamente negli alveoli dei topi riceventi mediante iniezione tracheale. La raccolta diretta di macrofagi di topo stimolati e il loro trasferimento adottivo negli alveoli riceventi è risultato aggravare il grado di fibrosi polmonare e può illustrare più chiaramente l’influenza dei fattori stimolanti sulla fibrosi rispetto agli studi precedenti6. La tecnica descritta in questo articolo può consentire ai ricercatori di esplorare la funzione dei macrofagi stimolati da potenziali citochine nello sviluppo dell’IPF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo studio fornisce un metodo efficace per esaurire, isolare, coltivare e trasferire i macrofagi, che può aiutare a studiare i meccanismi della fibrosi polmonare nei topi. Esistono molti metodi per l’esaurimento dei macrofagi di topo, come la somministrazione tracheale, l’iniezione della vena caudale e l’inalazione nasale11. Questo studio ha ottimizzato il metodo di inalazione nasale, che è semplice da utilizzare e può effettivamente esaurire i macrofagi polmonari <su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono il tema speciale della gestione del laboratorio dell’Università di Jiangnan: costruzione della biblioteca digitale delle fette basata su campioni patologici (JDSYS202223) e la National Natural Science Foundation of China (81800065).
Materials
| DMEM | Life technologies Biotechnology,USA | 1508012 | |
| Arterial indwelling needle | B Braun Melsingen AG,Germany | 21G15G8393 | |
| BD Accuri C6 Plus | Becton Dickinson,USA | ||
| Bleomycin | Biotang, USA | Ab9465 | |
| Carbon dioxide incubator | Thermo Forma, USA | Thermo Forma370 | |
| CD11b | R&D Systems,USA | 1124F | |
| CD11c | R&D Systems,USA | N418 | |
| Cell culture dish | Thermo Forma, USA | 174926 | |
| Clodronate liposomes | Clodronate liposomes,Netherlands | CI-150-150 | |
| Collagenase A | Sigma-Aldrich, USA | 10103578001 | |
| F4/80 | R&D Systems,USA | 521204 | |
| Falcon Cell Strainer | Becton,Dickinson and Company, USA | 352340 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies,USA | 1047571 | |
| Hematoxylin Eosin | Nanjing Jiancheng Technology,China | 06-570 | |
| LightCycler 480 PCR detection system | Roche, USA | ||
| Murine recombinant factor IL-33 | Peprotech, USA | 210-33 | |
| Nikon microscope | Nikon Corporation, Japan | 941185 | |
| Penicillin, streptomycin | Life technologies,USA | 877113 | |
| Phosphate buffer (PBS) | Guangdong Huankai Microbial Technology ,China | 1535882 | |
| RBC lysis buffer | Beyotime Biotechnology Company,China | C3702 | |
| RNA Isolater | Vazyme company,China | R401-01-AA | Total RNA extraction reagent |
| RWD Inhalation Anesthesia Machine | Shenzhen Rayward Life Technology ,China | R500 | |
| Semi-automatic paraffin slicer | Leica, Germany | LeicaRM2245 | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara, Japan | 410800 | |
| Trypsin 0.25% | Life Technologies, USA | 1627172 |
References
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