Адоптивный перенос IL-33-стимулированных макрофагов в блеомицин-индуцированные мышиные модели для изучения их влияния на идиопатический легочный фиброз in vivo
Summary
Этот протокол описывает выделение легочных интерстициальных макрофагов (ИМ) и их адоптивный перенос после стимуляции IL-33 альвеол легких на мышиной модели, что может облегчить исследование идиопатического легочного фиброза (IPF) in vivo .
Abstract
Воспалительная реакция, вызванная ранним повреждением легких, является одной из важных причин развития идиопатического легочного фиброза (ИЛФ), который сопровождается активацией воспалительных клеток, таких как макрофаги и нейтрофилы, а также высвобождением воспалительных факторов, включая TNF-α, IL-1β и IL-6. Известно, что раннее воспаление, вызванное активированными легочными интерстициальными макрофагами (ИМ) в ответ на стимуляцию IL-33, играет жизненно важную роль в патологическом процессе IPF. Этот протокол описывает адоптивный перенос IM, стимулированных IL-33, в легкие мышей для изучения развития IPF. Он включает в себя выделение и культивирование первичных IM из легких мыши-хозяина с последующим приемным переносом стимулированных IM в альвеолы мышей-реципиентов IPF, индуцированных блеомицином (BLM) (которые ранее были истощены альвеолярными макрофагами путем лечения клодронатными липосомами) и патологическую оценку этих мышей. Репрезентативные результаты показывают, что адоптивный перенос макрофагов, стимулированных IL-33, усугубляет легочный фиброз у мышей, что позволяет предположить, что проведение эксперимента по адоптивному переносу макрофагов является хорошим техническим средством для изучения патологии IPF.
Introduction
Идиопатический легочный фиброз (ИЛФ) – это диффузное воспалительное заболевание легких, вызванное многими факторами1. В цитокиновом микроокружении иммунного ответа Th1 и Th2 макрофаги могут быть поляризованы на классически активированные макрофаги (M1) и альтернативно активированные макрофаги (M2). Липополисахариды (ЛПС) или цитокин ИФН-γ индуцируют макрофаги М1 поляризоваться и продуцировать провоспалительные цитокины, включая iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α и IL-12. Напротив, цитокины II типа IL-4 и IL-13 управляют поляризацией макрофагов M2, которые могут продуцировать различные факторы, стимулирующие рост фибробластов, такие как TGF-β и PDGF, которые способствуют легочному фиброзу2. Патологический процесс ИЛФ сопровождается активацией и инфильтрацией макрофагов. IPF опосредует восстановление травмы, воспаление и фиброз за счет высвобождения цитокинов3. Поскольку доступны лишь ограниченные терапевтические возможности, изучение молекулярных патологических механизмов ИЛФ имеет большое значение для разработки новых стратегий профилактики и лечения ИЛФ. Предыдущие исследования, проведенные нашей группой и другими исследователями 4,5, подтвердили повышенное высвобождение IL-33 у пациентов с IPF и на мышиных моделях с блеомицином (BLM)-индуцированным IPF. IL-33 высвобождается эпителиальными и эндотелиальными клетками во время фиброза и участвует в активации макрофагов, что приводит к аномальной пролиферации фибробластов, инфильтрации лейкоцитов и, в конечном итоге, к потере функции легких5. Текущий протокол описывает адоптивный перенос IL-33-стимулированных интерстициальных макрофагов (IM) в альвеолы в качестве средства изучения развития IPF на мышиных моделях. Здесь IM выделяли из легочной ткани мышей-хозяев, культивировали in vitro, стимулировали IL-33 в течение 24 ч, а затем адоптивно переносили в альвеолы мышей-реципиентов путем инъекции в трахею. Было обнаружено, что прямой сбор стимулированных макрофагов мыши и их адаптационный перенос в альвеолы реципиента усугубляет степень легочного фиброза и может более наглядно проиллюстрировать влияние стимулирующих факторов на фиброз по сравнению с предыдущими исследованиями6. Метод, описанный в этой статье, может позволить исследователям изучить функцию макрофагов, стимулируемых потенциальными цитокинами, в развитии IPF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Это исследование предоставляет эффективный метод истощения, изоляции, культивирования и переноса макрофагов, который может помочь в изучении механизмов легочного фиброза у мышей. Существует множество методов истощения макрофагов мыши, таких как введение в трахею, инъекция в хвостову…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают специальную тему управления лабораторией Цзяннаньского университета: создание библиотеки цифровых срезов на основе патологических образцов (JDSYS202223) и Национального фонда естественных наук Китая (81800065).
Materials
| DMEM | Life technologies Biotechnology,USA | 1508012 | |
| Arterial indwelling needle | B Braun Melsingen AG,Germany | 21G15G8393 | |
| BD Accuri C6 Plus | Becton Dickinson,USA | ||
| Bleomycin | Biotang, USA | Ab9465 | |
| Carbon dioxide incubator | Thermo Forma, USA | Thermo Forma370 | |
| CD11b | R&D Systems,USA | 1124F | |
| CD11c | R&D Systems,USA | N418 | |
| Cell culture dish | Thermo Forma, USA | 174926 | |
| Clodronate liposomes | Clodronate liposomes,Netherlands | CI-150-150 | |
| Collagenase A | Sigma-Aldrich, USA | 10103578001 | |
| F4/80 | R&D Systems,USA | 521204 | |
| Falcon Cell Strainer | Becton,Dickinson and Company, USA | 352340 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies,USA | 1047571 | |
| Hematoxylin Eosin | Nanjing Jiancheng Technology,China | 06-570 | |
| LightCycler 480 PCR detection system | Roche, USA | ||
| Murine recombinant factor IL-33 | Peprotech, USA | 210-33 | |
| Nikon microscope | Nikon Corporation, Japan | 941185 | |
| Penicillin, streptomycin | Life technologies,USA | 877113 | |
| Phosphate buffer (PBS) | Guangdong Huankai Microbial Technology ,China | 1535882 | |
| RBC lysis buffer | Beyotime Biotechnology Company,China | C3702 | |
| RNA Isolater | Vazyme company,China | R401-01-AA | Total RNA extraction reagent |
| RWD Inhalation Anesthesia Machine | Shenzhen Rayward Life Technology ,China | R500 | |
| Semi-automatic paraffin slicer | Leica, Germany | LeicaRM2245 | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara, Japan | 410800 | |
| Trypsin 0.25% | Life Technologies, USA | 1627172 |
References
- Heukels, P., Moor, C. C., vonder Thüsen, J. H., Wijsenbeek, M. S., Kool, M. Inflammation and immunity in IPF pathogenesis and treatment. Respiratory Medicine. 147, 79-91 (2019).
- Zhang, Y., Zhang, Y., Li, X., Zhang, M., Lv, J. Microarray analysis of circular RNA expression patterns in polarized macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 39 (2), 373-379 (2017).
- Lee, J. W., et al. The role of macrophages in the development of acute and chronic inflammatory lung diseases. Cells. 10 (4), 897 (2021).
- Luzina, I. G., et al. Interleukin-33 potentiates bleomycin-induced lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (6), 999-1008 (2013).
- Nie, Y., et al. AKT2 regulates pulmonary inflammation and fibrosis via modulating macrophage activation. Journal of Immunology. 198 (11), 4470-4480 (2017).
- Qian, F., et al. The transcription factor PU.1 promotes alternative macrophage polarization and asthmatic airway inflammation. Journal of Molecular Cell Biology. 7 (6), 557-567 (2015).
- Shah, S., Dhawan, V., Holm, R., Nagarsenker, M. S., Perrie, Y. Liposomes: Advancements and innovation in the manufacturing process. Advanced Drug Delivery Reviews. 154 (155), 102-122 (2020).
- He, W., et al. Alveolar macrophages are critical for broadly-reactive antibody-mediated protection against influenza A virus in mice. Nature Communications. 8 (1), 846 (2017).
- Eyal, F. G., Hamm, C. R., Parker, J. C. Reduction in alveolar macrophages attenuates acute ventilator induced lung injury in rats. Intensive Care Medicine. 33 (7), 1212-1218 (2007).
- Hübner, R. H., et al. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples. Biotechniques. 44 (4), 507-517 (2008).
- Tacke, F., et al. Immature monocytes acquire antigens from other cells in the bone marrow and present them to T cells after maturing in the periphery. The Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 583-597 (2006).
- Byrne, A. J., Maher, T. M., Lloyd, C. M. Pulmonary macrophages: A new therapeutic pathway in fibrosing lung disease. Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 303-316 (2016).
- Wendisch, D., et al. SARS-CoV-2 infection triggers profibrotic macrophage responses and lung fibrosis. Cell. 184 (26), 6243-6261 (2021).
- Zhang, L., et al. Macrophages: Friend or foe in idiopathic pulmonary fibrosis. Respiratory Research. 19 (1), 170 (2018).
