النقل بالتبني للبلاعم المحفزة ب IL-33 إلى نماذج الفئران المستحثة بالبليوميسين لدراسة تأثيرها على التليف الرئوي مجهول السبب في الجسم الحي
Summary
يصف هذا البروتوكول عزل الضامة الخلالية الرئوية (IMs) ونقلها بالتبني بعد تحفيز IL-33 للحويصلات الهوائية الرئوية في نموذج الفأر ، والذي يمكن أن يسهل الدراسة في الجسم الحي للتليف الرئوي مجهول السبب (IPF).
Abstract
تعد الاستجابة الالتهابية الناجمة عن إصابة الرئة المبكرة أحد الأسباب المهمة لتطور التليف الرئوي مجهول السبب (IPF) ، والذي يصاحبه تنشيط الخلايا الالتهابية مثل الضامة والعدلات ، بالإضافة إلى إطلاق العوامل الالتهابية بما في ذلك TNF-α و IL-1β و IL-6. من المعروف أن الالتهاب المبكر الناجم عن الضامة الخلالية الرئوية المنشطة (IMs) استجابة لتحفيز IL-33 يلعب دورا حيويا في العملية المرضية ل IPF. يصف هذا البروتوكول النقل بالتبني للرسائل العضلية التي يحفزها IL-33 إلى رئتي الفئران لدراسة تطور IPF. وهو ينطوي على عزل وزراعة الحقن العضلي الأولي من رئتي الفأر المضيف ، يليه النقل بالتبني للرسائل العضلية المحفزة إلى الحويصلات الهوائية للفئران المتلقية IPF التي يسببها بليوميسين (BLM) (والتي تم استنفادها سابقا من البلاعم السنخية عن طريق العلاج بالليبوزومات الشحمية كلودرونات) ، والتقييم المرضي لتلك الفئران. تظهر النتائج التمثيلية أن النقل بالتبني للبلاعم المحفزة IL-33 يؤدي إلى تفاقم التليف الرئوي في الفئران ، مما يشير إلى أن إنشاء تجربة نقل البلاعم بالتبني هو وسيلة تقنية جيدة لدراسة أمراض IPF.
Introduction
التليف الرئوي مجهول السبب (IPF) هو مرض التهابي رئوي منتشر تسببه العديد من العوامل1. في البيئة المكروية السيتوكينية للاستجابة المناعية Th1 و Th2 ، يمكن استقطاب البلاعم إلى بلاعم منشطة بشكل كلاسيكي (M1) وبلاعم نشطة بدلا من ذلك (M2). تحفز عديدات السكاريد الدهنية (LPS) أو السيتوكين IFN- γ الضامة M1 على استقطاب وإنتاج السيتوكينات المؤيدة للالتهابات ، بما في ذلك iNOS و IL-1 و IL-6 و TNF-α و IL-12. في المقابل ، فإن السيتوكينات من النوع الثاني IL-4 و IL-13 تقود استقطاب الضامة M2 ، والتي يمكن أن تنتج عوامل مختلفة لتعزيز نمو الخلايا الليفية ، مثل TGF-β و PDGF ، التي تعزز التليف الرئوي2. ويرافق العملية المرضية ل IPF تنشيط البلاعم والتسلل. يتوسط IPF إصلاح الإصابة والالتهاب والتليف من خلال إطلاق السيتوكينات3. نظرا لتوفر خيارات علاجية محدودة فقط ، فإن استكشاف الآليات المرضية الجزيئية ل IPF يحمل أهمية كبيرة لتطوير استراتيجيات جديدة للوقاية من IPF وعلاجه. أكدت الدراسات السابقة التي أجرتها مجموعتنا وباحثون آخرون 4,5 زيادة إطلاق IL-33 في مرضى IPF وفي نماذج الفئران مع بليوميسين (BLM) الناجم عن IPF. يتم إطلاق IL-33 بواسطة الخلايا الظهارية والبطانية أثناء التليف ويشارك في تنشيط البلاعم ، مما يؤدي إلى تكاثر غير طبيعي للخلايا الليفية ، وتسلل الكريات البيض ، وفقدان وظائف الرئة في نهاية المطاف5. يصف البروتوكول الحالي النقل بالتبني للبلاعم الخلالية المحفزة IL-33 (IMs) إلى الحويصلات الهوائية كوسيلة لدراسة تطور IPF في نماذج الفئران. هنا ، تم عزل IMs من أنسجة الرئة للفئران المضيفة ، وزرعت في المختبر ، وحفزت مع IL-33 لمدة 24 ساعة ، ثم نقلها بالتبني إلى الحويصلات الهوائية للفئران المتلقية عن طريق حقن القصبة الهوائية. تم العثور على المجموعة المباشرة من البلاعم الفأر المحفزة ونقلها بالتبني إلى الحويصلات الهوائية المتلقية لتفاقم درجة التليف الرئوي ويمكن أن توضح بشكل أوضح تأثير العوامل المحفزة على التليف مقارنة بالدراسات السابقة6. يمكن للتقنية الموصوفة في هذه الورقة أن تمكن الباحثين من استكشاف وظيفة الضامة التي تحفزها السيتوكينات المحتملة في تطوير IPF.
Protocol
Representative Results
Discussion
توفر هذه الدراسة طريقة فعالة لاستنفاد البلاعم وعزلها واستزراعها ونقلها ، والتي يمكن أن تساعد في دراسة آليات التليف الرئوي في الفئران. هناك العديد من الطرق لاستنفاد بلاعم الفئران ، مثل إدارة القصبة الهوائية ، وحقن الوريد الذيل ، واستنشاق الأنف11. حسنت هذه الدراسة طريقة استنشا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يقر المؤلفون بالموضوع الخاص لإدارة المختبرات بجامعة جيانغنان: بناء مكتبة شرائح رقمية تعتمد على العينات المرضية (JDSYS202223) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81800065).
Materials
| DMEM | Life technologies Biotechnology,USA | 1508012 | |
| Arterial indwelling needle | B Braun Melsingen AG,Germany | 21G15G8393 | |
| BD Accuri C6 Plus | Becton Dickinson,USA | ||
| Bleomycin | Biotang, USA | Ab9465 | |
| Carbon dioxide incubator | Thermo Forma, USA | Thermo Forma370 | |
| CD11b | R&D Systems,USA | 1124F | |
| CD11c | R&D Systems,USA | N418 | |
| Cell culture dish | Thermo Forma, USA | 174926 | |
| Clodronate liposomes | Clodronate liposomes,Netherlands | CI-150-150 | |
| Collagenase A | Sigma-Aldrich, USA | 10103578001 | |
| F4/80 | R&D Systems,USA | 521204 | |
| Falcon Cell Strainer | Becton,Dickinson and Company, USA | 352340 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies,USA | 1047571 | |
| Hematoxylin Eosin | Nanjing Jiancheng Technology,China | 06-570 | |
| LightCycler 480 PCR detection system | Roche, USA | ||
| Murine recombinant factor IL-33 | Peprotech, USA | 210-33 | |
| Nikon microscope | Nikon Corporation, Japan | 941185 | |
| Penicillin, streptomycin | Life technologies,USA | 877113 | |
| Phosphate buffer (PBS) | Guangdong Huankai Microbial Technology ,China | 1535882 | |
| RBC lysis buffer | Beyotime Biotechnology Company,China | C3702 | |
| RNA Isolater | Vazyme company,China | R401-01-AA | Total RNA extraction reagent |
| RWD Inhalation Anesthesia Machine | Shenzhen Rayward Life Technology ,China | R500 | |
| Semi-automatic paraffin slicer | Leica, Germany | LeicaRM2245 | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara, Japan | 410800 | |
| Trypsin 0.25% | Life Technologies, USA | 1627172 |
References
- Heukels, P., Moor, C. C., vonder Thüsen, J. H., Wijsenbeek, M. S., Kool, M. Inflammation and immunity in IPF pathogenesis and treatment. Respiratory Medicine. 147, 79-91 (2019).
- Zhang, Y., Zhang, Y., Li, X., Zhang, M., Lv, J. Microarray analysis of circular RNA expression patterns in polarized macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 39 (2), 373-379 (2017).
- Lee, J. W., et al. The role of macrophages in the development of acute and chronic inflammatory lung diseases. Cells. 10 (4), 897 (2021).
- Luzina, I. G., et al. Interleukin-33 potentiates bleomycin-induced lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (6), 999-1008 (2013).
- Nie, Y., et al. AKT2 regulates pulmonary inflammation and fibrosis via modulating macrophage activation. Journal of Immunology. 198 (11), 4470-4480 (2017).
- Qian, F., et al. The transcription factor PU.1 promotes alternative macrophage polarization and asthmatic airway inflammation. Journal of Molecular Cell Biology. 7 (6), 557-567 (2015).
- Shah, S., Dhawan, V., Holm, R., Nagarsenker, M. S., Perrie, Y. Liposomes: Advancements and innovation in the manufacturing process. Advanced Drug Delivery Reviews. 154 (155), 102-122 (2020).
- He, W., et al. Alveolar macrophages are critical for broadly-reactive antibody-mediated protection against influenza A virus in mice. Nature Communications. 8 (1), 846 (2017).
- Eyal, F. G., Hamm, C. R., Parker, J. C. Reduction in alveolar macrophages attenuates acute ventilator induced lung injury in rats. Intensive Care Medicine. 33 (7), 1212-1218 (2007).
- Hübner, R. H., et al. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples. Biotechniques. 44 (4), 507-517 (2008).
- Tacke, F., et al. Immature monocytes acquire antigens from other cells in the bone marrow and present them to T cells after maturing in the periphery. The Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 583-597 (2006).
- Byrne, A. J., Maher, T. M., Lloyd, C. M. Pulmonary macrophages: A new therapeutic pathway in fibrosing lung disease. Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 303-316 (2016).
- Wendisch, D., et al. SARS-CoV-2 infection triggers profibrotic macrophage responses and lung fibrosis. Cell. 184 (26), 6243-6261 (2021).
- Zhang, L., et al. Macrophages: Friend or foe in idiopathic pulmonary fibrosis. Respiratory Research. 19 (1), 170 (2018).
