העברה מאומצת של מקרופאגים מעוררי IL-33 למודלים של עכברים הנגרמים על ידי בלומיצין כדי לחקור את השפעתם על פיברוזיס ריאתי אידיופתי in vivo
Summary
פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של מקרופאגים אינטרסטיציאליים ריאתיים (IMs) ואת העברתם המאומצת לאחר גירוי IL-33 של נאדיות הריאה במודל עכבר, אשר יכול להקל על מחקר in vivo של פיברוזיס ריאתי אידיופתי (IPF).
Abstract
התגובה הדלקתית הנגרמת על ידי פגיעה ריאתית מוקדמת היא אחד הגורמים החשובים להתפתחות פיברוזיס ריאתי אידיופתי (IPF), המלווה בהפעלת תאים דלקתיים כגון מקרופאגים ונויטרופילים, כמו גם שחרור של גורמים דלקתיים כולל TNF-α, IL-1β ו- IL-6. דלקת מוקדמת הנגרמת על ידי מקרופאגים אינטרסטיציאליים ריאתיים פעילים (IMs) בתגובה לגירוי IL-33 ידועה כממלאת תפקיד חיוני בתהליך הפתולוגי של IPF. פרוטוקול זה מתאר העברה מאומצת של IMs שעוררו IL-33 לריאות של עכברים כדי לחקור את התפתחות IPF. היא כוללת בידוד ותרבית של IMs ראשוניים מריאות עכבר מארח, ולאחר מכן העברה מאומצת של IMs מעוררים לתוך alveoli של עכברים מושתלי IPF המושרה על ידי בלומיצין (BLM) (אשר כבר רוקנו בעבר מקרופאגים alveolar על ידי טיפול עם ליפוזומים clodronate), ואת ההערכה הפתולוגית של עכברים אלה. התוצאות המייצגות מראות כי העברה מאומצת של מקרופאגים מעוררי IL-33 מחמירה פיברוזיס ריאתי בעכברים, דבר המצביע על כך שהקמת ניסוי העברת המקרופאגים המאמצת היא אמצעי טכני טוב לחקר פתולוגיה של IPF.
Introduction
פיברוזיס ריאתי אידיופתי (IPF) היא מחלה דלקתית ריאתית מפושטת הנגרמת על ידי גורמים רבים1. במיקרו-סביבה הציטוקינים של התגובה החיסונית Th1 ו-Th2, מקרופאגים יכולים להיות מקוטבים למקרופאגים המופעלים באופן קלאסי (M1) ולמקרופאגים מופעלים לחלופין (M2). ליפופוליסכרידים (LPS) או הציטוקין IFN- γ גורמים למקרופאגים M1 לקטב ולייצר ציטוקינים מעודדי דלקת, כולל iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α ו-IL-12. לעומת זאת, ציטוקינים מסוג II IL-4 ו-IL-13 מניעים את הקיטוב של מקרופאגים M2, אשר יכולים לייצר גורמים שונים המעודדים גדילה של פיברובלסטים, כגון TGF-β ו-PDGF, המקדמים פיברוזיס ריאתי2. התהליך הפתולוגי של IPF מלווה בהפעלת מקרופאגים וחדירה. IPF מתווך תיקון פציעות, דלקת ופיברוזיס באמצעות שחרור ציטוקינים3. מכיוון שרק אפשרויות טיפוליות מוגבלות זמינות, חקירת המנגנונים הפתולוגיים המולקולריים של IPF היא בעלת משמעות רבה לפיתוח אסטרטגיות חדשות למניעה וטיפול ב- IPF. מחקרים קודמים של הקבוצה שלנו וחוקרים אחרים 4,5 אישרו את השחרור המוגבר של IL-33 בחולי IPF ובמודלים של עכברים עם IPF המושרה על ידי בלומיצין (BLM). IL-33 משתחרר על-ידי תאי אפיתל ואנדותל במהלך פיברוזיס ומעורב בהפעלת מקרופאגים, מה שגורם להתרבות חריגה של פיברובלסטים, הסננת לויקוציטים, ובסופו של דבר אובדן תפקוד ריאות5. הפרוטוקול הנוכחי מתאר העברה מאומצת של מקרופאגים אינטרסטיציאליים (IMs) מעוררי IL-33 לתוך הנאדיות כאמצעי לחקר התפתחות IPF במודלים של עכברים. כאן, IMs בודדו מרקמת הריאה של עכברים מארחים, גודלו בתרבית במבחנה, עוררו עם IL-33 במשך 24 שעות, ולאחר מכן הועברו באופן מאומץ לנאדיות של עכברים מושתלים על ידי הזרקת קנה הנשימה. האיסוף הישיר של מקרופאגים עכבריים מעוררים והעברתם המאומצת לנאדיות המקבל נמצא כמחמיר את מידת הפיברוזיס הריאתי ויכול להמחיש בצורה ברורה יותר את ההשפעה של גורמים מעוררים על פיברוזיס בהשוואה למחקרים קודמים6. הטכניקה המתוארת במאמר זה יכולה לאפשר לחוקרים לחקור את תפקודם של מקרופאגים המעוררים על ידי ציטוקינים פוטנציאליים בהתפתחות IPF.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקר זה מספק שיטה יעילה לדלדול, בידוד, תרבית והעברת מקרופאגים, אשר יכולה לסייע בחקר המנגנונים של פיברוזיס ריאתי בעכברים. ישנן שיטות רבות לדלדול מקרופאגים בעכברים, כגון ניהול קנה הנשימה, הזרקת ורידים בזנב ושאיפת אף11. מחקר זה ייעל את שיטת שאיפת האף, שהיא פשוטה לתפעול ויכולה לרוק?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מכירים בנושא המיוחד של ניהול מעבדה באוניברסיטת ג’יאנגנאן: בניית ספריית פרוסה דיגיטלית המבוססת על דגימות פתולוגיות (JDSYS202223) והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81800065).
Materials
| DMEM | Life technologies Biotechnology,USA | 1508012 | |
| Arterial indwelling needle | B Braun Melsingen AG,Germany | 21G15G8393 | |
| BD Accuri C6 Plus | Becton Dickinson,USA | ||
| Bleomycin | Biotang, USA | Ab9465 | |
| Carbon dioxide incubator | Thermo Forma, USA | Thermo Forma370 | |
| CD11b | R&D Systems,USA | 1124F | |
| CD11c | R&D Systems,USA | N418 | |
| Cell culture dish | Thermo Forma, USA | 174926 | |
| Clodronate liposomes | Clodronate liposomes,Netherlands | CI-150-150 | |
| Collagenase A | Sigma-Aldrich, USA | 10103578001 | |
| F4/80 | R&D Systems,USA | 521204 | |
| Falcon Cell Strainer | Becton,Dickinson and Company, USA | 352340 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life technologies,USA | 1047571 | |
| Hematoxylin Eosin | Nanjing Jiancheng Technology,China | 06-570 | |
| LightCycler 480 PCR detection system | Roche, USA | ||
| Murine recombinant factor IL-33 | Peprotech, USA | 210-33 | |
| Nikon microscope | Nikon Corporation, Japan | 941185 | |
| Penicillin, streptomycin | Life technologies,USA | 877113 | |
| Phosphate buffer (PBS) | Guangdong Huankai Microbial Technology ,China | 1535882 | |
| RBC lysis buffer | Beyotime Biotechnology Company,China | C3702 | |
| RNA Isolater | Vazyme company,China | R401-01-AA | Total RNA extraction reagent |
| RWD Inhalation Anesthesia Machine | Shenzhen Rayward Life Technology ,China | R500 | |
| Semi-automatic paraffin slicer | Leica, Germany | LeicaRM2245 | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara, Japan | 410800 | |
| Trypsin 0.25% | Life Technologies, USA | 1627172 |
References
- Heukels, P., Moor, C. C., vonder Thüsen, J. H., Wijsenbeek, M. S., Kool, M. Inflammation and immunity in IPF pathogenesis and treatment. Respiratory Medicine. 147, 79-91 (2019).
- Zhang, Y., Zhang, Y., Li, X., Zhang, M., Lv, J. Microarray analysis of circular RNA expression patterns in polarized macrophages. International Journal of Molecular Medicine. 39 (2), 373-379 (2017).
- Lee, J. W., et al. The role of macrophages in the development of acute and chronic inflammatory lung diseases. Cells. 10 (4), 897 (2021).
- Luzina, I. G., et al. Interleukin-33 potentiates bleomycin-induced lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (6), 999-1008 (2013).
- Nie, Y., et al. AKT2 regulates pulmonary inflammation and fibrosis via modulating macrophage activation. Journal of Immunology. 198 (11), 4470-4480 (2017).
- Qian, F., et al. The transcription factor PU.1 promotes alternative macrophage polarization and asthmatic airway inflammation. Journal of Molecular Cell Biology. 7 (6), 557-567 (2015).
- Shah, S., Dhawan, V., Holm, R., Nagarsenker, M. S., Perrie, Y. Liposomes: Advancements and innovation in the manufacturing process. Advanced Drug Delivery Reviews. 154 (155), 102-122 (2020).
- He, W., et al. Alveolar macrophages are critical for broadly-reactive antibody-mediated protection against influenza A virus in mice. Nature Communications. 8 (1), 846 (2017).
- Eyal, F. G., Hamm, C. R., Parker, J. C. Reduction in alveolar macrophages attenuates acute ventilator induced lung injury in rats. Intensive Care Medicine. 33 (7), 1212-1218 (2007).
- Hübner, R. H., et al. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples. Biotechniques. 44 (4), 507-517 (2008).
- Tacke, F., et al. Immature monocytes acquire antigens from other cells in the bone marrow and present them to T cells after maturing in the periphery. The Journal of Experimental Medicine. 203 (3), 583-597 (2006).
- Byrne, A. J., Maher, T. M., Lloyd, C. M. Pulmonary macrophages: A new therapeutic pathway in fibrosing lung disease. Trends in Molecular Medicine. 22 (4), 303-316 (2016).
- Wendisch, D., et al. SARS-CoV-2 infection triggers profibrotic macrophage responses and lung fibrosis. Cell. 184 (26), 6243-6261 (2021).
- Zhang, L., et al. Macrophages: Friend or foe in idiopathic pulmonary fibrosis. Respiratory Research. 19 (1), 170 (2018).
