Ensaio verde de malaquita para a descoberta de inibidores da proteína de choque térmico 90

A proteína de choque térmico 90 (Hsp90) é uma chaperona molecular que mantém a estabilidade de proteínas responsáveis pelo desenvolvimento e progressão do câncer. Além disso, proteínas responsáveis pelo desenvolvimento de resistência a agentes antineoplásicos também são clientes da Hsp90¹. A Hsp90 é superexpressa de forma ubíqua em todos os tipos de células cancerosas (>90% das proteínas celulares), em comparação com as células normais, onde pode constituir menos de 2% das proteínas totais. Além disso, a Hsp90 das células cancerosas reside em um complexo com cochaperonas, enquanto em uma célula normal está presente predominantemente em um estado livre e não^{complexado 2,3}. Nos últimos anos, vários inibidores de Hsp90 demonstraram possuir efeitos senolíticos em estudos in vitro e in vivo, onde melhoraram significativamente o tempo de vida de camundongos 4,5,6. Todos os achados acima corroboram o fato de que os inibidores de Hsp90 poderiam ser efetivos em múltiplos tipos de câncer, com menos efeitos adversos e menores chances de desenvolver resistência. A função de chaperoning da Hsp90 é realizada ligando-se ao ATP no domínio N-terminal da Hsp90 e hidrolisando-o em ADP e fosfato livre⁷. Pequenas moléculas que se ligam competitivamente à bolsa de ligação de ATP de Hsp90 foram encontradas para suprimir com sucesso o efeito de chaperoning da proteína. Até o momento, essa continua sendo a melhor estratégia para a inibição da Hsp90, o que é apoiado pelo fato de tais inibidores terem chegado a ensaios clínicos⁸. Um deles, o Pimitespib, foi aprovado no Japão para o tratamento do tumor estromal gastrointestinal (GIST) em junho de 2022⁹. Este é o primeiro inibidor de Hsp90 aprovado desde que a farmacogabilidade da chaperona foi estabelecida em 1994¹⁰.

O ensaio verde de malaquita é um procedimento simples, sensível, rápido e de baixo custo para a detecção de fosfato inorgânico, adequado para automação e triagem de alto rendimento (HTS) de compostos contra seu alvo desejado¹¹. O ensaio foi empregado com sucesso para a triagem de inibidores de Hsp90 em pequenos montamentos em escala laboratorial, bem como em uma HTS 12,13,14,15,16,17. O ensaio utiliza um método colorimétrico que determina o fosfato inorgânico livre formado devido à atividade ATPase da Hsp90. A base dessa quantificação é a formação de um complexo fosfomolibdato entre fosfato livre e molibdênio, que posteriormente reage com o verde malaquita para gerar uma cor verde (Figura 1). Essa rápida formação de cor é medida em espectrofotômetro, ou em leitor de placas, entre 600-660 nm^18,19.

No presente protocolo, descreve-se o procedimento para a realização do ensaio verde de malaquita com a levedura Hsp90 e posterior identificação de inibidores contra a chaperona. A molécula do produto natural, geldanamicina (GA), com a qual a farmacogabilidade da Hsp90 foi estabelecida pela primeira vez, foi tomada como um inibidor autêntico¹⁰. A HTS tornou-se parte integrante do atual programa de descoberta de fármacos, devido à disponibilidade de um grande número de moléculas para testes. Essa técnica ganhou mais importância nos últimos 2 anos devido à necessidade urgente de reaproveitamento de medicamentos para o tratamento da infecção por Covid-19^20,21. Portanto, um esboço detalhado para a HTS de moléculas contra a proteína Hsp90 da levedura adotando o método de ensaio verde de malaquita é apresentado.