Dosage vert de malachite pour la découverte d’inhibiteurs de la protéine 90 de choc thermique

La protéine de choc thermique 90 (Hsp90) est un chaperon moléculaire qui maintient la stabilité des protéines responsables du développement et de la progression du cancer. De plus, les protéines responsables du développement de la résistance aux agents antinéoplasiques sont également clientes de Hsp90¹. Hsp90 est surexprimé de façon ubiquitaire dans tous les types de cellules cancéreuses (>90% des protéines cellulaires), par rapport aux cellules normales où il peut constituer moins de 2% des protéines totales. De plus, le Hsp90 des cellules cancéreuses réside dans un complexe avec des co-chaperons, alors que dans une cellule normale, il est présent principalement à l’état libre^et non complexé ^2,3. Au cours des dernières années, il a été démontré que plusieurs inhibiteurs de Hsp90 possèdent des effets sénolytiques dans des études in vitro et in vivo, où ils ont considérablement amélioré la durée de vie des souris 4,5,6. Tous les résultats susmentionnés corroborent le fait que les inhibiteurs de Hsp90 pourraient être efficaces dans plusieurs types de cancer, avec moins d’effets indésirables et moins de risques de développer une résistance. La fonction chaperonnante de Hsp90 est accomplie en liant l’ATP au domaine N-terminal de Hsp90 et en l’hydrolysant en ADP et en phosphate libre⁷. De petites molécules qui se lient de manière compétitive à la poche de liaison ATP de Hsp90 se sont avérées supprimer avec succès l’effet chaperonnant de la protéine. À ce jour, cela reste la meilleure stratégie pour l’inhibition de Hsp90, ce qui est soutenu par le fait que ces inhibiteurs ont atteint les essais cliniques⁸. L’un d’eux, Pimitespib, a été approuvé au Japon pour le traitement de la tumeur stromale gastro-intestinale (GIST) en juin 2022⁹. Il s’agit du premier inhibiteur de Hsp90 approuvé depuis que la pharmacogabilité du chaperon a été établie en 1994¹⁰.

Le dosage vert malachite est une procédure simple, sensible, rapide et peu coûteuse pour la détection du phosphate inorganique, adaptée à l’automatisation et au criblage à haut débit (HTS) de composés par rapport à sa cible^{souhaitée 11}. Le test a été utilisé avec succès pour le criblage des inhibiteurs de Hsp90 dans de petites installations à l’échelle du laboratoire, ainsi que dans un HTS 12,13,14,15,16,17. Le test utilise une méthode colorimétrique qui détermine le phosphate inorganique libre formé en raison de l’activité ATPase de Hsp90. La base de cette quantification est la formation d’un complexe phosphomolybdate entre le phosphate libre et le molybdène, qui réagit ensuite avec le vert malachite pour générer une couleur verte (Figure 1). Cette formation rapide de couleur est mesurée sur un spectrophotomètre, ou sur un lecteur de plaques, entre 600-660 nm^18,19.

Dans le présent protocole, la procédure à suivre pour effectuer un dosage au vert de malachite avec la levure Hsp90 et l’identification ultérieure des inhibiteurs contre le chaperon sont décrites. La molécule de produit naturel, la geldanamycine (GA), avec laquelle la pharmacogabilité de Hsp90 a été établie pour la première fois, a été prise comme inhibiteur authentique¹⁰. HTS est devenu une partie intégrante du programme actuel de découverte de médicaments, en raison de la disponibilité d’un grand nombre de molécules pour les tests. Cette technique a gagné en importance au cours des 2 dernières années en raison du besoin urgent de réorienter les médicaments pour traiter l’infection Covid-19^20,21. Par conséquent, un aperçu détaillé de l’HTS des molécules contre la protéine de levure Hsp90 en adoptant la méthode de dosage vert malachite est présenté.