熱ショックタンパク質90阻害剤の発見のためのマラカイトグリーンアッセイ

ヒートショックタンパク質90(Hsp90)は、癌の発症と進行に関与するタンパク質の安定性を維持する分子シャペロンです。さらに、抗悪性腫瘍剤に対する耐性の発達に関与するタンパク質もHsp90¹のクライアントである。Hsp90は、全タンパク質の2%未満を占める可能性のある正常細胞と比較して、すべての癌細胞タイプ(細胞タンパク質の>90%)に遍在的に過剰発現しています。さらに、がん細胞のHsp90はコシャペロンとの複合体に存在しますが、正常細胞では、主に遊離で複合体のない状態で存在します^2,3。近年、いくつかのHsp90阻害剤が、インビトロおよびインビボ研究において老化細胞除去効果を有することが実証されており、マウスの寿命を有意に改善している4,5,6。前述のすべての発見は、Hsp90阻害剤が複数の種類の癌に有効であり、副作用が少なく、耐性を発症する可能性が低いという事実を実証しています。Hsp90のシャペロン機能は、Hsp90のN末端ドメインにATPを結合し、それをADPと遊離リン酸に加水分解することによって達成されます⁷。Hsp90のATP結合ポケットに競合的に結合する低分子は、タンパク質のシャペロン化効果を抑制することに成功した。今日まで、これはHsp90阻害のための最良の戦略であり、そのような阻害剤が臨床試験に達したという事実によって裏付けられています⁸。そのうちの1つであるピミテスピブは、2022年6月に消化管間質腫瘍(GIST)の治療薬として日本で承認されました^9。これは、シャペロンの創薬性が1994年に確立されて以来、承認された最初のHsp90阻害剤です¹⁰。

マラカイトグリーンアッセイは、無機リン酸塩を検出するためのシンプルで高感度、高速かつ安価な手順であり、目的のターゲットに対する化合物の自動化およびハイスループットスクリーニング(HTS)に適しています¹¹。このアッセイは、小規模なラボスケールのセットアップやHTS 12、^13、14、15、^16、17でのHsp90阻害剤のスクリーニングに成功しています。このアッセイは、Hsp90のATPアーゼ活性により形成される遊離無機リン酸を測定する比色法を使用します。この定量の基礎は、遊離リン酸とモリブデンの間にリンモリブデン酸錯体が形成され、その後マラカイトグリーンと反応して緑色を生成することです(図1)。この急速な発色は、分光光度計またはプレートリーダー上で、600〜660nmの間で測定される^18,19。

本プロトコールでは、酵母Hsp90を用いたマラカイトグリーンアッセイを実施する手順およびその後のシャペロンに対する阻害剤の同定が記載されている。Hsp90の創薬性が最初に確立された天然物分子であるゲルダナマイシン(GA)は、本物の阻害剤として摂取されました¹⁰。HTSは、テスト用の多数の分子が利用可能であるため、現在の創薬プログラムの不可欠な部分になっています。この技術は、Covid-19感染症を治療するための薬物の転用が緊急に必要であるため、過去2年間でより重要性を増しています^20,21。そこで、マラカイトグリーンアッセイ法を採用した酵母Hsp90タンパク質に対するHTSの分子について詳細な概要が提示される。