Ensayo de verde de malaquita para el descubrimiento de inhibidores de la proteína 90 de choque térmico
Summary
El protocolo de ensayo de verde de malaquita es un método simple y rentable para descubrir supresores de la proteína de choque térmico 90 (Hsp90), así como otros compuestos inhibidores contra enzimas dependientes de ATP.
Abstract
La proteína de choque térmico 90 (Hsp90) es un objetivo anticancerígeno prometedor debido a su efecto de acompañamiento en múltiples proteínas oncogénicas. La actividad de Hsp90 depende de su capacidad para hidrolizar trifosfato de adenosina (ATP) a difosfato de adenosina (ADP) y fosfato libre. La actividad ATPasa de Hsp90 está vinculada a su función de acompañamiento; El ATP se une al dominio N-terminal del Hsp90, y se encontró que interrumpir su enlace era la estrategia más exitosa para suprimir la función Hsp90. La actividad de la ATPasa se puede medir mediante un ensayo colorimétrico de verde de malaquita, que determina la cantidad de fosfato libre formado por hidrólisis de ATP. Aquí, se describe un procedimiento para determinar la actividad ATPasa de la levadura Hsp90 utilizando el kit de ensayo de fosfato verde de malaquita. Además, se proporcionan instrucciones detalladas para el descubrimiento de inhibidores de Hsp90 tomando geldanamicina como un inhibidor auténtico. Finalmente, se discute la aplicación de este protocolo de ensayo a través del cribado de alto rendimiento (HTS) de moléculas inhibidoras contra levadura Hsp90.
Introduction
La proteína de choque térmico 90 (Hsp90) es una chaperona molecular que mantiene la estabilidad de las proteínas responsables del desarrollo y la progresión del cáncer. Además, las proteínas responsables del desarrollo de resistencia a los agentes antineoplásicos también son clientes de Hsp901. Hsp90 se sobreexpresa ubicuamente en todos los tipos de células cancerosas (>90% de las proteínas celulares), en comparación con las células normales donde puede constituir menos del 2% del total de proteínas. Además, el Hsp90 de las células cancerosas reside en un complejo con co-chaperonas, mientras que en una célula normal está presente predominantemente en un estado libre y no complejado 2,3. En los últimos años, se ha demostrado que varios inhibidores de Hsp90 poseen efectos senolíticos en estudios in vitro e in vivo, donde han mejorado significativamente la vida útil de ratones 4,5,6. Todos los hallazgos antes mencionados corroboran el hecho de que los inhibidores de Hsp90 podrían ser efectivos en múltiples tipos de cáncer, con menos efectos adversos y menores posibilidades de desarrollar resistencia. La función de acompañamiento de Hsp90 se logra uniendo ATP en el dominio N-terminal de Hsp90 e hidrolizándolo en ADP y fosfato libre7. Se encontró que las moléculas pequeñas que se unen competitivamente al bolsillo de unión al ATP de Hsp90 suprimen con éxito el efecto de acompañamiento de la proteína. Hasta la fecha, esta sigue siendo la mejor estrategia para la inhibición de Hsp90, lo que está respaldado por el hecho de que tales inhibidores han alcanzado ensayos clínicos8. Uno de ellos, Pimitespib, fue aprobado en Japón para el tratamiento del tumor del estroma gastrointestinal (GIST) en junio de 20229. Este es el primer inhibidor de Hsp90 aprobado desde que se estableció la farmacogabilidad de la chaperona en 199410.
El ensayo verde de malaquita es un procedimiento simple, sensible, rápido y económico para la detección de fosfato inorgánico, adecuado para la automatización y el cribado de alto rendimiento (HTS) de compuestos contra su objetivo deseado11. El ensayo se ha empleado con éxito para el cribado de inhibidores de Hsp90 en pequeñas configuraciones a escala de laboratorio, así como en un HTS 12,13,14,15,16,17. El ensayo utiliza un método colorimétrico que determina el fosfato inorgánico libre formado debido a la actividad ATPasa de Hsp90. La base de esta cuantificación es la formación de un complejo de fosfomolibdato entre fosfato libre y molibdeno, que posteriormente reacciona con el verde malaquita para generar un color verde (Figura 1). Esta rápida formación de color se mide en un espectrofotómetro, o en un lector de placas, entre 600-660 nm18,19.
En el presente protocolo, se describe el procedimiento para llevar a cabo un ensayo de verde de malaquita con levadura Hsp90 y la posterior identificación de inhibidores contra la chaperona. La molécula de producto natural, geldanamicina (GA), con la que se estableció por primera vez la farmacogabilidad de Hsp90, fue tomada como un inhibidor auténtico10. HTS se ha convertido en una parte integral del programa actual de descubrimiento de fármacos, debido a la disponibilidad de un gran número de moléculas para pruebas. Esta técnica ha ganado más importancia en los últimos 2 años debido a la necesidad urgente de reutilizar medicamentos para tratar la infección por Covid-1920,21. Por lo tanto, se presenta un esquema detallado para el HTS de moléculas contra la proteína Hsp90 de levadura mediante la adopción del método de ensayo verde de malaquita.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hsp90 es un objetivo importante para el descubrimiento de nuevas moléculas de fármacos contra el cáncer. Desde que se estableció su farmacogabilidad en 199410, 18 moléculas han llegado a ensayos clínicos. En la actualidad, siete moléculas se encuentran en diversas fases de ensayos clínicos, ya sea solas o en combinación22. Todas estas moléculas pequeñas son inhibidores de unión al ATP N-terminal. Los otros medios para inhibir la chaperona (inhibidores C-terminal…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por el programa Korea Research Fellowship (KRF), becario postdoctoral de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Ciencia y TIC (NRF-2019H1D3A1A01102952). Los autores agradecen la subvención intramuros de KIST y la subvención número 2MRB130 del Ministerio de Océanos y Pesca por proporcionar asistencia financiera para este proyecto.
Materials
| 1M Magnesium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 63069-100ml | |
| 1M Potassium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 60142-100ml | |
| 96-well plate | SPL Life Sciences | Not applicable | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A7699-5G | |
| Biomek FX laboratory automation workstation | Beckman Coulter | Not applicable | |
| Compounds 3-96 | Not applicable | Not applicable | Histidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues. |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Geldanamycin, 99% (HPLC), powder | AK Scientific, Inc. | V2064 | |
| Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher Scientific | 10977015 | |
| Malachite Green Phosphate Assay Assay kit | Sigma-Aldrich | MAK307-1KT | |
| Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Synergy HT multi-plate reader | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4 | Sigma-Aldrich | 93313-1L | |
| Yeast Hsp90 | Not applicable | Not applicable | School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829 |
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