Malachiet Green Assay voor de ontdekking van heat-shock eiwit 90-remmers
Summary
Het malachiet green assay protocol is een eenvoudige en kosteneffectieve methode om heat shock protein 90 (Hsp90) suppressors te ontdekken, evenals andere remmers tegen ATP-afhankelijke enzymen.
Abstract
Heat shock protein 90 (Hsp90) is een veelbelovend doelwit tegen kanker vanwege het chaperonerende effect op meerdere oncogene eiwitten. De activiteit van Hsp90 is afhankelijk van het vermogen om adenosinetrifosfaat (ATP) te hydrolyseren tot adenosinedifosfaat (ADP) en vrij fosfaat. De ATPase-activiteit van Hsp90 is gekoppeld aan zijn chaperoningfunctie; ATP bindt aan het N-terminale domein van de Hsp90 en het verstoren van de binding bleek de meest succesvolle strategie te zijn in het onderdrukken van de Hsp90-functie. De ATPase-activiteit kan worden gemeten met een colorimetrische malachietgroene assay, die de hoeveelheid vrij fosfaat bepaalt die wordt gevormd door ATP-hydrolyse. Hier wordt een procedure beschreven voor het bepalen van de ATPase-activiteit van gist Hsp90 met behulp van de malachietgroene fosfaattestkit. Verder worden gedetailleerde instructies gegeven voor de ontdekking van Hsp90-remmers door geldanamycine als een authentieke remmer te nemen. Tot slot wordt de toepassing van dit assay protocol door middel van de high-throughput screening (HTS) van remmermoleculen tegen gist Hsp90 besproken.
Introduction
Heat shock protein 90 (Hsp90) is een moleculaire chaperonne die de stabiliteit van eiwitten die verantwoordelijk zijn voor de ontwikkeling en progressie van kanker handhaaft. Daarnaast zijn eiwitten die verantwoordelijk zijn voor de ontwikkeling van resistentie tegen antineoplastische middelen ook klanten van Hsp901. Hsp90 wordt alomtegenwoordig overexpressie gegeven in alle soorten kankercellen (>90% van de cellulaire eiwitten), vergeleken met normale cellen waar het minder dan 2% van de totale eiwitten kan vormen. Bovendien bevindt de Hsp90 van kankercellen zich in een complex met co-chaperones, terwijl het in een normale cel voornamelijk aanwezig is in een vrije, niet-gecomplexeerde toestand 2,3. In de afgelopen jaren is aangetoond dat verschillende Hsp90-remmers senolytische effecten hebben in in vitro en in vivo studies, waar ze de levensduur van muizen aanzienlijk hebben verbeterd 4,5,6. Alle bovengenoemde bevindingen onderbouwen het feit dat Hsp90-remmers effectief kunnen zijn bij meerdere soorten kanker, met minder bijwerkingen en verminderde kans op het ontwikkelen van resistentie. De chaperoningfunctie van Hsp90 wordt bereikt door ATP te binden aan het N-terminale domein van Hsp90 en het te hydrolyseren tot ADP en vrij fosfaat7. Kleine moleculen die competitief binden aan de ATP-bindingspocket van Hsp90 bleken met succes het chaperoning-effect van het eiwit te onderdrukken. Tot op heden blijft dit de beste strategie voor Hsp90-remming, wat wordt ondersteund door het feit dat dergelijke remmers klinische onderzoeken hebben bereikt8. Een daarvan, Pimitespib, werd in juni 2022 in Japan goedgekeurd voor de behandeling van gastro-intestinale stromale tumor (GIST)9. Dit is de eerste Hsp90-remmer die is goedgekeurd sinds de druggability van de chaperonne werd vastgesteld in 199410.
De malachietgroene test is een eenvoudige, gevoelige, snelle en goedkope procedure voor de detectie van anorganisch fosfaat, geschikt voor automatisering en high-throughput screening (HTS) van verbindingen tegen het gewenste doel11. De test is met succes gebruikt voor de screening van Hsp90-remmers in kleine laboratoriumopstellingen, evenals in een HTS 12,13,14,15,16,17. De test maakt gebruik van een colorimetrische methode die het vrije anorganische fosfaat bepaalt dat wordt gevormd door de ATPase-activiteit van Hsp90. De basis van deze kwantificering is de vorming van een fosfolybdaatcomplex tussen vrij fosfaat en molybdeen, dat vervolgens reageert met malachietgroen om een groene kleur te genereren (figuur 1). Deze snelle kleurvorming wordt gemeten op een spectrofotometer, of op een plaatlezer, tussen 600-660 nm18,19.
In dit protocol wordt de procedure beschreven voor het uitvoeren van een malachietgroene test met gist Hsp90 en de daaropvolgende identificatie van remmers tegen de chaperonne. Het natuurlijke productmolecuul, geldanamycine (GA), waarmee de druggability van Hsp90 voor het eerst werd vastgesteld, werd als een authentieke remmer10 genomen. HTS is een integraal onderdeel geworden van het huidige programma voor het ontdekken van geneesmiddelen, vanwege de beschikbaarheid van een groot aantal moleculen voor testen. Deze techniek heeft de afgelopen 2 jaar meer betekenis gekregen vanwege de dringende behoefte aan herbestemming van geneesmiddelen voor de behandeling van Covid-19-infectie20,21. Daarom wordt een gedetailleerd overzicht gepresenteerd voor de HTS van moleculen tegen gist Hsp90-eiwit door de malachietgroene testmethode toe te passen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hsp90 is een belangrijk doelwit voor de ontdekking van nieuwe moleculen tegen kanker. Sinds de druggability werd vastgesteld in 199410, 18 moleculen hebben klinische proeven bereikt. Op dit moment bevinden zeven moleculen zich in verschillende fasen van klinische onderzoeken, alleen of in combinatie22. Al deze kleine moleculen zijn N-terminale ATP-bindingsremmers. De andere middelen om de chaperonne te remmen (C-terminale remmers, middendomeinremmers) zijn niet zo snel gega…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door het Korea Research Fellowship (KRF) -programma, postdoctoraal fellow van de National Research Foundation of Korea (NRF), gefinancierd door het ministerie van wetenschap en ICT (NRF-2019H1D3A1A01102952). De auteurs zijn KIST intramurale subsidie en ministerie van Oceanen en Visserij subsidienummer 2MRB130 dankbaar voor het verstrekken van financiële steun voor dit project.
Materials
| 1M Magnesium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 63069-100ml | |
| 1M Potassium chloride solution in water | Sigma-Aldrich | 60142-100ml | |
| 96-well plate | SPL Life Sciences | Not applicable | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A7699-5G | |
| Biomek FX laboratory automation workstation | Beckman Coulter | Not applicable | |
| Compounds 3-96 | Not applicable | Not applicable | Histidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues. |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Geldanamycin, 99% (HPLC), powder | AK Scientific, Inc. | V2064 | |
| Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | ThermoFisher Scientific | 10977015 | |
| Malachite Green Phosphate Assay Assay kit | Sigma-Aldrich | MAK307-1KT | |
| Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Synergy HT multi-plate reader | Biotek Instruments, Inc. | Not applicable | |
| Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4 | Sigma-Aldrich | 93313-1L | |
| Yeast Hsp90 | Not applicable | Not applicable | School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829 |
References
- Workman, P. Combinatorial attack on multistep oncogenesis by inhibiting the Hsp90 molecular chaperone. Cancer Letters. 206 (2), 149-157 (2004).
- Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (7), 515-528 (2010).
- Mahalingam, D., et al. Targeting HSP90 for cancer therapy. British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).
- Dutta Gupta, S., Pan, C. H. Recent update on discovery and development of Hsp90 inhibitors as senolytic agents. International Journal of Biological Macromolecules. 161, 1086-1098 (2020).
- Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics. Nature Communications. 8 (1), 422 (2017).
- Fuhrmann-Stroissnigg, H., Niedernhofer, L. J., Robbins, P. D. Hsp90 inhibitors as senolytic drugs to extend healthy aging. Cell Cycle. 17 (9), 1048-1055 (2018).
- Pearl, L. H., Prodromou, C. Structure and mechanism of the Hsp90 molecular chaperone machinery. Annual Review of Biochemistry. 75, 271-294 (2006).
- Park, H. -. K., et al. Unleashing the full potential of Hsp90 inhibitors as cancer therapeutics through simultaneous inactivation of Hsp90, Grp94, and TRAP1. Experimental & molecular medicine. 52 (1), 79-91 (2020).
- Hoy, S. M. Pimitespib: first approval. Drugs. 82 (13), 1413-1418 (2022).
- Whitesell, L., Mimnaugh, E. G., De Costa, B., Myers, C. E., Neckers, L. M. Inhibition of heat shock protein HSP90-pp60v-src heteroprotein complex formation by benzoquinone ansamycins: essential role for stress proteins in oncogenic transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (18), 8324-8328 (1994).
- Rowlands, M. G., et al. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).
- Sheikha, G. A., Al-Sha’er, M. A., Taha, M. O. Some sulfonamide drugs inhibit ATPase activity of heat shock protein 90: investigation by docking simulation and experimental validation. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 26 (5), 603-609 (2011).
- Al-Sha’er, M. A., Mansi, I., Hakooz, N. Docking and pharmacophore mapping of halogenated pyridinium derivatives on heat shock protein 90. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 7 (4), 103-112 (2015).
- Al-Sha’er, M. A., Taha, M. O. Elaborate ligand-based modeling reveals new nanomolar heat shock protein 90α inhibitors. Journal of Chemical Information and Modeling. 50 (9), 1706-1723 (2010).
- Al-Sha’er, M. A., Taha, M. O. Rational exploration of new pyridinium-based HSP90α inhibitors tailored to thiamine structure. Medicinal Chemistry Research. 21 (4), 487-510 (2012).
- Al-Sha’er, M. A., Taha, M. O. Application of docking-based comparative intermolecular contacts analysis to validate Hsp90α docking studies and subsequent in silico screening for inhibitors. Journal of Molecular Modeling. 18 (11), 4843-4863 (2012).
- Dutta Gupta, S., et al. 2,4-dihydroxy benzaldehyde derived Schiff bases as small molecule Hsp90 inhibitors: rational identification of a new anticancer lead. Bioorganic Chemistry. 59, 97-105 (2015).
- Feng, J., et al. An improved malachite green assay of phosphate: mechanism and application. Analytical Biochemistry. 409 (1), 144-149 (2011).
- Gupta, S. D., et al. Molecular docking study, synthesis and biological evaluation of Mannich bases as Hsp90 inhibitors. International Journal of Biological Macromolecules. 80, 253-259 (2015).
- Zhao, Y., et al. High-throughput screening identifies established drugs as SARS-CoV-2 PLpro inhibitors. Protein & Cell. 12 (11), 877-888 (2021).
- Giri, A. K., Ianevski, A. High-throughput screening for drug discovery targeting the cancer cell-microenvironment interactions in hematological cancers. Expert Opinion on Drug Discovery. 17 (2), 181-190 (2022).
- Mahapatra, D. K., et al. Heat shock protein 90 (Hsp90) inhibitory potentials of some chalcone compounds as novel anti-proliferative candidates. Advanced Studies in Experimental and Clinical. , 107-122 (2021).
- Jaeger, A. M., Whitesell, L. HSP90: enabler of cancer adaptation. Annual Review of Cancer Biology. 3, 275-297 (2019).
- Yang, S., Xiao, H., Cao, L. Recent advances in heat shock proteins in cancer diagnosis, prognosis, metabolism and treatment. Biomedicine & Pharmacotherapy. 142, 112074 (2021).
- Mishra, S. J., et al. The development of Hsp90β-selective inhibitors to overcome detriments associated with pan-Hsp90 inhibition. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (3), 1545-1557 (2021).
- Khandelwal, A., et al. Structure-guided design of an Hsp90beta N-terminal isoform-selective inhibitor. Nature Communications. 9 (1), 425 (2018).
- Wang, Y., Koay, Y. C., McAlpine, S. R. How selective are Hsp90 inhibitors for cancer cells over normal cells. ChemMedChem. 12 (5), 353-357 (2017).
- Panaretou, B., et al. ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo. The EMBO Journal. 17 (16), 4829-4836 (1998).
- Banerjee, M., Hatial, I., Keegan, B. M., Blagg, B. S. J. Assay design and development strategies for finding Hsp90 inhibitors and their role in human diseases. Pharmacology & Therapeutics. 221, 107747 (2021).
- Howes, R., et al. A fluorescence polarization assay for inhibitors of Hsp90. Analytical Biochemistry. 350 (2), 202-213 (2006).
- Opalińska, M., Jańska, H. AAA proteases: guardians of mitochondrial function and homeostasis. Cells. 7 (10), 163 (2018).
- Ambrose, A. J., Chapman, E. Function, therapeutic potential, and inhibition of Hsp70 chaperones. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (11), 7060-7082 (2021).
- Cheng, I., Mikita, N., Fishovitz, J., Frase, H., Wintrode, P., Lee, I. Identification of a region in the N-terminus of Escherichia coli Lon that affects ATPase, substrate translocation and proteolytic activity. Journal of Molecular Biology. 418 (3-4), 208-225 (2012).
