Imágenes de lapso de tiempo 3D de la dinámica de la pared celular usando calcofluor en musgo Physcomitrium patens
Summary
Este manuscrito presenta un protocolo detallado para obtener imágenes de la dinámica de la pared celular 3D del tejido de musgo vivo, lo que permite la visualización del desprendimiento de las paredes celulares en mutantes ggb y engrosar los patrones de pared celular en el tipo salvaje durante el desarrollo durante un largo período.
Abstract
Las imágenes de lapso de tiempo con microscopía de fluorescencia permiten observar los cambios dinámicos de crecimiento y desarrollo a nivel celular y subcelular. En general, para observaciones durante un período prolongado, la técnica requiere la transformación de una proteína fluorescente; Sin embargo, para la mayoría de los sistemas, la transformación genética requiere mucho tiempo o no está técnicamente disponible. Este manuscrito presenta un protocolo para imágenes de lapso de tiempo 3D de la dinámica de la pared celular durante un período de 3 días utilizando colorante calcofluor (que tiñe la celulosa en la pared celular de la planta), desarrollado en el musgo Physcomitrium patens. La señal de colorante calcofluor de la pared celular es estable y puede durar 1 semana sin descomposición obvia. Usando este método, se ha demostrado que el desprendimiento de células en mutantes ggb (en el que la proteína geranilgeraniltransferasa-I subunidad beta es eliminada) es causado por la expansión celular no regulada y defectos de integridad de la pared celular. Además, los patrones de tinción de calcofluor cambian con el tiempo; Las regiones menos intensamente teñidas se correlacionan con los futuros sitios de expansión / ramificación celular en el tipo silvestre. Este método se puede aplicar a muchos otros sistemas que contienen paredes celulares y que pueden ser teñidos por calcofluor.
Introduction
Las paredes celulares de las plantas experimentan cambios dinámicos durante la expansión y el desarrollo celular 1,2,3. Mantener la integridad de la pared celular es fundamental para la adhesión de las células vegetales durante el crecimiento y el desarrollo, así como para la respuesta a las señales ambientales. Aunque visualizar la dinámica de la pared celular de las células vivas durante un largo período de tiempo es fundamental para comprender cómo se mantiene la adhesión celular durante el desarrollo y la adaptación a los cambios ambientales, los métodos actuales para observar directamente la dinámica de la pared celular siguen siendo un desafío.
Las imágenes de lapso de tiempo de los cambios celulares pueden proporcionar una dinámica informativa del desarrollo de un organismo utilizando un microscopio de fluorescencia de alta resolución 4,5,6,7. Si bien las imágenes 3D de lapso de tiempo tienen un gran potencial para estudiar los cambios dinámicos de la forma celular durante el crecimiento y el desarrollo, la técnica normalmente requiere la transformación de una proteína fluorescente 4,5,6,7. Sin embargo, para la mayoría de los sistemas, las transformaciones genéticas requieren mucho tiempo o son técnicamente desafiantes. Como alternativa, los tintes fluorescentes que se adhieren a los componentes celulares han estado disponibles durante mucho tiempo. Los colorantes fluorescentes pueden emitir luz fluorescente después de la irradiación con luz de cierta longitud de onda. Ejemplos comunes son Edu, DAPI, PI, FM4-64 y calcofluor blanco 8,9,10. Un inconveniente importante, sin embargo, es que estos colorantes generalmente solo se pueden usar en tejido fijo o para experimentos cortos, en parte debido al daño que causan a la célula 8,9,10.
Con el protocolo presentado aquí, las señales de calcofluor son estables cuando el blanco de calcofluor se mezcla dentro del medio durante los experimentos de lapso de tiempo en el musgo P. patens. Usando este método, se observó el desprendimiento de células en mutantes ggb utilizando imágenes de lapso de tiempo 3D durante un período de 3 días3 (Figura 1). Este método se puede aplicar a muchos otros sistemas que contienen paredes celulares y que pueden ser teñidos por calcofluor.
Protocol
Representative Results
Discussion
La reconstrucción 3D de lapso de tiempo, o imágenes 4D, es una herramienta poderosa para observar la dinámica de la morfología celular durante los procesos de desarrollo. En este protocolo, al mezclar el blanco de calcofluor en el medio, se puede observar la dinámica de la morfología celular 3D en el musgo P. patens. Usando este método, observamos que la superficie de las paredes celulares en los mutantes ggb se desgarra durante el desarrollo3. Además, el engrosamiento re…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Soucy Patricia y Betty Nunn de la Universidad de Louisville por su ayuda con el microscopio confocal. Este trabajo fue financiado por la National Science Foundation (1456884 a M.P.R.) y por un Acuerdo de Cooperación de la National Science Foundation (1849213 a M.P.R.).
Materials
| 3-mm-thick red plastic light filter | Mitsubishi | no.102 | |
| 27 mm diameter glass base dish | Iwaki | 3930-035 | |
| Agar | Sigma | A6924 | |
| Calcofluor white | Sigma | 18909-100ML-F | Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L |
| Confocal microscope | Nikon | A1 |
NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. |
| Fluorescence microscope | Nikon | TE200 | Equipped with a DS-U3 camera; |
| Gellan gum | Nacali Tesque | 12389-96 | |
| Plant Growth Chambers | SANYO | Sanyo MLR-350H | |
| Sterilized syringe 0.22 μm filter | Millipore | SLGV033RS |
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