3D-Zeitraffer-Bildgebung der Zellwanddynamik mit Calcofluor im Moos Physcomitrium patens
Summary
Dieses Manuskript stellt ein detailliertes Protokoll zur Abbildung der 3D-Zellwanddynamik von lebendem Moosgewebe vor, das die Visualisierung der Ablösung von Zellwänden in ggb-Mutanten und die Verdickung von Zellwandmustern im Wildtyp während der Entwicklung über einen langen Zeitraum ermöglicht.
Abstract
Zeitrafferaufnahmen mit Fluoreszenzmikroskopie ermöglichen die Beobachtung der dynamischen Veränderungen von Wachstum und Entwicklung auf zellulärer und subzellulärer Ebene. Im Allgemeinen erfordert die Technik für Beobachtungen über einen langen Zeitraum die Umwandlung eines fluoreszierenden Proteins. Für die meisten Systeme ist die genetische Transformation jedoch entweder zeitaufwendig oder technisch nicht verfügbar. Dieses Manuskript stellt ein Protokoll für die 3D-Zeitraffer-Bildgebung der Zellwanddynamik über einen Zeitraum von 3 Tagen unter Verwendung des Calcofluorfarbstoffs (der Zellulose in der pflanzlichen Zellwand färbt) vor, der im Moos Physcomitrium patens entwickelt wurde. Das Calcofluor-Farbstoffsignal von der Zellwand ist stabil und kann 1 Woche ohne offensichtlichen Zerfall anhalten. Mit dieser Methode konnte gezeigt werden, dass die Ablösung von Zellen in ggb-Mutanten (bei denen die Protein-Geranylgeranyltransferase-I-beta-Untereinheit ausgeschaltet ist) durch unregulierte Zellexpansion und Zellwandintegritätsdefekte verursacht wird. Darüber hinaus ändern sich die Muster der Calcofluor-Färbung im Laufe der Zeit; Weniger intensiv gefärbte Regionen korrelieren mit den zukünftigen Zellexpansions-/Verzweigungsstellen im Wildtyp. Diese Methode kann auf viele andere Systeme angewendet werden, die Zellwände enthalten und die mit Calcofluor gefärbt werden können.
Introduction
Pflanzliche Zellwände unterliegen dynamischen Veränderungen während der Zellexpansion und -entwicklung 1,2,3. Die Aufrechterhaltung der Zellwandintegrität ist entscheidend für die Adhäsion von Pflanzenzellen während des Wachstums und der Entwicklung sowie für die Reaktion auf Umweltsignale. Obwohl die Visualisierung der Zellwanddynamik lebender Zellen über einen langen Zeitraum entscheidend ist, um zu verstehen, wie die Zelladhäsion während der Entwicklung und Anpassung an Umweltveränderungen aufrechterhalten wird, sind die aktuellen Methoden zur direkten Beobachtung der Zellwanddynamik immer noch eine Herausforderung.
Die Zeitraffer-Bildgebung zellulärer Veränderungen kann mit einem hochauflösenden Fluoreszenzmikroskop 4,5,6,7 Aufschluss über die Entwicklungsdynamik eines Organismus geben. Während die Zeitraffer-3D-Bildgebung ein großes Potenzial für die Untersuchung dynamischer Veränderungen der Zellform während des Wachstums und der Entwicklung bietet, erfordert die Technik normalerweise die Transformation eines fluoreszierenden Proteins 4,5,6,7. Für die meisten Systeme sind genetische Transformationen jedoch entweder zeitaufwendig oder technisch anspruchsvoll. Als Alternative stehen seit langem Fluoreszenzfarbstoffe zur Verfügung, die an zelluläre Bestandteile binden. Die Fluoreszenzfarbstoffe können nach Bestrahlung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge Fluoreszenzlicht emittieren. Gängige Beispiele sind Edu, DAPI, PI, FM4-64 und Calcofluorweiß 8,9,10. Ein großer Nachteil ist jedoch, dass diese Farbstoffe typischerweise nur in festem Gewebe oder für kurze Experimente verwendet werden können, zum Teil aufgrund der Schäden, die sie für die Zelle verursachen 8,9,10.
Mit dem hier vorgestellten Protokoll sind Calcofluor-Signale stabil, wenn Calcofluor-Weiß während Zeitraffer-Experimenten im Moos P. patens innerhalb des Mediums gemischt wird. Mit dieser Methode wurde die Ablösung von Zellen in ggb-Mutanten mittels 3D-Zeitraffer-Bildgebung über einen Zeitraum von 3 Tagen beobachtet3 (Abbildung 1). Diese Methode kann auf viele andere Systeme angewendet werden, die Zellwände enthalten und die mit Calcofluor gefärbt werden können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Zeitraffer-3D-Rekonstruktion oder 4D-Bildgebung ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Dynamik der Zellmorphologie während Entwicklungsprozessen zu beobachten. In diesem Protokoll kann durch Mischen des Calcofluorweißes in das Medium die Dynamik der 3-D-Zellmorphologie im Moos P. patens beobachtet werden. Mit dieser Methode beobachteten wir, dass die Oberfläche von Zellwänden in ggb-Mutanten während der Entwicklungauseinandergerissen wird 3. Darüber hinaus korrelier…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Soucy Patricia und Betty Nunn von der University of Louisville für die Unterstützung mit dem konfokalen Mikroskop. Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation (1456884 to M.P.R.) und durch ein National Science Foundation Cooperative Agreement (1849213 to M.P.R.) finanziert.
Materials
| 3-mm-thick red plastic light filter | Mitsubishi | no.102 | |
| 27 mm diameter glass base dish | Iwaki | 3930-035 | |
| Agar | Sigma | A6924 | |
| Calcofluor white | Sigma | 18909-100ML-F | Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L |
| Confocal microscope | Nikon | A1 |
NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. |
| Fluorescence microscope | Nikon | TE200 | Equipped with a DS-U3 camera; |
| Gellan gum | Nacali Tesque | 12389-96 | |
| Plant Growth Chambers | SANYO | Sanyo MLR-350H | |
| Sterilized syringe 0.22 μm filter | Millipore | SLGV033RS |
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