Moss Physcomitrium patens'te Calcofluor Kullanarak Hücre Duvarı Dinamiğinin 3-D Hızlandırılmış Görüntülenmesi
Summary
Bu makale, canlı yosun dokusunun 3 boyutlu hücre duvarı dinamiklerini görüntülemek için ayrıntılı bir protokol sunarak, ggb mutantlarında hücre duvarlarının ayrılmasının görselleştirilmesine ve uzun bir süre boyunca gelişim sırasında vahşi tipte hücre duvarı desenlerinin kalınlaştırılmasına izin vermektedir.
Abstract
Floresan mikroskobu ile hızlandırılmış görüntüleme, hücresel ve hücre altı seviyelerde büyüme ve gelişmenin dinamik değişikliklerinin gözlemlenmesini sağlar. Genel olarak, uzun bir süre boyunca gözlemler için, teknik bir floresan proteininin dönüşümünü gerektirir; Bununla birlikte, çoğu sistem için genetik dönüşüm ya zaman alıcıdır ya da teknik olarak kullanılamaz. Bu makale, yosun Physcomitrium patens’te geliştirilen calcofluor boyası (bitki hücre duvarındaki selülozu boyayan) kullanılarak 3 günlük bir süre boyunca hücre duvarı dinamiklerinin 3 boyutlu hızlandırılmış görüntülenmesi için bir protokol sunmaktadır. Hücre duvarından gelen kalkoflor boya sinyali stabildir ve belirgin bir çürüme olmadan 1 hafta sürebilir. Bu yöntem kullanılarak, ggb mutantlarındaki hücrelerin ayrılmasının (protein geranilgeraniltransferaz-I beta alt biriminin nakavt edildiği) düzenlenmemiş hücre genişlemesi ve hücre duvarı bütünlüğü kusurlarından kaynaklandığı gösterilmiştir. Ayrıca, kalkoflor boyama kalıpları zamanla değişir; daha az yoğun boyanmış bölgeler, vahşi tipteki gelecekteki hücre genişlemesi / dallanma bölgeleri ile ilişkilidir. Bu yöntem, hücre duvarları içeren ve kalkoflor tarafından boyanabilen diğer birçok sisteme uygulanabilir.
Introduction
Bitki hücre duvarları, hücre genişlemesi ve gelişimi sırasında dinamik değişikliklere uğrar 1,2,3. Hücre duvarı bütünlüğünün korunması, büyüme ve gelişme sırasında bitki hücresi yapışması ve çevresel sinyallere verilen yanıt için kritik öneme sahiptir. Canlı hücrelerin hücre duvarı dinamiklerini uzun bir süre boyunca görselleştirmek, gelişim sırasında hücre yapışmasının nasıl korunduğunu ve çevresel değişikliklere adaptasyonun nasıl korunduğunu anlamak için kritik öneme sahip olsa da, hücre duvarı dinamiklerini doğrudan gözlemlemek için mevcut yöntemler hala zordur.
Hücresel değişikliklerin hızlandırılmış görüntülemesi, yüksek çözünürlüklü bir floresan mikroskobu 4,5,6,7 kullanarak bir organizmanın bilgilendirici gelişimsel dinamiklerini sağlayabilir. Hızlandırılmış 3-D görüntüleme, büyüme ve gelişme sırasında hücre şeklindeki dinamik değişiklikleri incelemek için büyük bir potansiyele sahip olsa da, teknik normalde bir floresan proteininin 4,5,6,7 dönüşümünü gerektirir. Bununla birlikte, çoğu sistem için genetik dönüşümler ya zaman alıcı ya da teknik olarak zordur. Alternatif olarak, hücresel bileşenlere bağlanan floresan boyalar uzun zamandır mevcuttur. Floresan boyalar, belirli bir dalga boyundaki ışıkla ışınlamadan sonra floresan ışık yayabilir. Yaygın örnekler Edu, DAPI, PI, FM4-64 ve calcofluor white 8,9,10’dur. Bununla birlikte, önemli bir dezavantaj, bu boyaların tipik olarak yalnızca sabit dokuda veya kısa deneylerde, kısmen 8,9,10 hücresine verdikleri zarar nedeniyle kullanılabilmesidir.
Burada sunulan protokolle, yosun P. patenlerindeki hızlandırılmış deneyler sırasında calcofluor beyazı ortam içinde karıştırıldığında calcofluor sinyalleri kararlıdır. Bu yöntem kullanılarak, ggb mutantlarındaki hücrelerin 3 günlük bir süre boyunca 3 günlükbir süre boyunca 3 hızlandırılmış görüntüleme kullanılarak ayrılması gözlendi (Şekil 1). Bu yöntem, hücre duvarları içeren ve kalkoflor tarafından boyanabilen diğer birçok sisteme uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hızlandırılmış 3-D rekonstrüksiyon veya 4-D görüntüleme, gelişimsel süreçler sırasında hücresel morfolojinin dinamiklerini gözlemlemek için güçlü bir araçtır. Bu protokolde, kalkoflor beyazının ortama karıştırılmasıyla, yosun P. patens’te 3-D hücresel morfolojinin dinamikleri gözlemlenebilir. Bu yöntemi kullanarak, ggb mutantlarındaki hücre duvarlarının yüzeyinin gelişim sırasında parçalandığını gözlemledik3. Ayrıca, hücre duvarlar?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Louisville Üniversitesi’nden Dr. Soucy Patricia ve Betty Nunn’a konfokal mikroskopla ilgili yardımları için teşekkür ediyor. Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı (M.P.R.’ye 1456884) ve Ulusal Bilim Vakfı İşbirliği Anlaşması (M.P.R.’ye 1849213) tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| 3-mm-thick red plastic light filter | Mitsubishi | no.102 | |
| 27 mm diameter glass base dish | Iwaki | 3930-035 | |
| Agar | Sigma | A6924 | |
| Calcofluor white | Sigma | 18909-100ML-F | Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L |
| Confocal microscope | Nikon | A1 |
NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. |
| Fluorescence microscope | Nikon | TE200 | Equipped with a DS-U3 camera; |
| Gellan gum | Nacali Tesque | 12389-96 | |
| Plant Growth Chambers | SANYO | Sanyo MLR-350H | |
| Sterilized syringe 0.22 μm filter | Millipore | SLGV033RS |
References
- Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
- Vaahtera, L., Schulz, J., Hamann, T. Cell wall integrity maintenance during plant development and interaction with the environment. Naure Plants. 5 (9), 924-932 (2019).
- Bao, L., et al. The cellular function of ROP GTPase prenylation important for multicellularity in the moss Physcomitrium patens. Development. 149 (12), (2022).
- Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: From probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).
- Fang, Y., Spector, D. L. Live cell imaging of plants. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), (2010).
- Goh, T. Long-term live-cell imaging approaches to study lateral root formation in Arabidopsis thaliana. Microscopy. 68 (1), 4-12 (2019).
- Hamant, O., Das, P., Burian, A. Time-lapse imaging of developing shoot meristems using a confocal laser scanning microscope. Methods in Molecular Biology. 1992, 257-268 (2019).
- Rigal, A., Doyle, S. M., Robert, S. Live cell imaging of FM4-64, a tool for tracing the endocytic pathways in Arabidopsis root cells. Methods in Molecular Biology. 1242, 93-103 (2015).
- Yagi, N., et al. Advances in synthetic fluorescent probe labeling for live-cell imaging in plants. Plant & Cell Physiology. 62 (8), 1259-1268 (2021).
- Whitewoods, C. D., et al. CLAVATA was a genetic novelty for the morphological innovation of 3D growth in land plants. Current Biology. 28 (15), 2365-2376 (2018).
- Bao, L., et al. A PSTAIRE-type cyclin-dependent kinase controls light responses in land plants. Science Advances. 8 (4), 2116 (2022).
