Imaging time-lapse 3D della dinamica della parete cellulare utilizzando il calcofluor nel muschio Physcomitrium patens
Summary
Questo manoscritto presenta un protocollo dettagliato per visualizzare le dinamiche della parete cellulare 3D del tessuto di muschio vivente, consentendo la visualizzazione del distacco delle pareti cellulari nei mutanti ggb e l’ispessimento dei modelli di parete cellulare nel tipo selvatico durante lo sviluppo per un lungo periodo.
Abstract
L’imaging time-lapse con microscopia a fluorescenza consente l’osservazione dei cambiamenti dinamici di crescita e sviluppo a livello cellulare e subcellulare. In generale, per osservazioni su un lungo periodo, la tecnica richiede la trasformazione di una proteina fluorescente; Tuttavia, per la maggior parte dei sistemi, la trasformazione genetica richiede tempo o tecnicamente non è disponibile. Questo manoscritto presenta un protocollo per l’imaging time-lapse 3D della dinamica della parete cellulare per un periodo di 3 giorni utilizzando colorante calcofluor (che colora la cellulosa nella parete cellulare della pianta), sviluppato nel muschio Physcomitrium patens. Il segnale del colorante calcofluor dalla parete cellulare è stabile e può durare per 1 settimana senza evidente decadimento. Utilizzando questo metodo, è stato dimostrato che il distacco delle cellule nei mutanti ggb (in cui la subunità beta della proteina geranilgeraniltransferasi-I viene eliminata) è causato dall’espansione cellulare non regolata e da difetti di integrità della parete cellulare. Inoltre, i modelli di colorazione del calcofluor cambiano nel tempo; Le regioni meno intensamente colorate sono correlate con i futuri siti di espansione/ramificazione cellulare nel tipo selvatico. Questo metodo può essere applicato a molti altri sistemi che contengono pareti cellulari e che possono essere colorati dal calcofluor.
Introduction
Le pareti cellulari delle piante subiscono cambiamenti dinamici durante l’espansione e lo sviluppo cellulare 1,2,3. Il mantenimento dell’integrità della parete cellulare è fondamentale per l’adesione delle cellule vegetali durante la crescita e lo sviluppo, nonché per la risposta ai segnali ambientali. Sebbene visualizzare le dinamiche della parete cellulare delle cellule viventi per un lungo periodo di tempo sia fondamentale per capire come viene mantenuta l’adesione cellulare durante lo sviluppo e l’adattamento ai cambiamenti ambientali, i metodi attuali per osservare direttamente le dinamiche della parete cellulare sono ancora impegnativi.
L’imaging time-lapse dei cambiamenti cellulari può fornire dinamiche di sviluppo informative di un organismo utilizzando un microscopio a fluorescenza ad alta risoluzione 4,5,6,7. Mentre l’imaging 3D time-lapse ha un grande potenziale per studiare i cambiamenti dinamici della forma cellulare durante la crescita e lo sviluppo, la tecnica normalmente richiede la trasformazione di una proteina fluorescente 4,5,6,7. Tuttavia, per la maggior parte dei sistemi, le trasformazioni genetiche richiedono tempo o sono tecnicamente impegnative. In alternativa, i coloranti fluorescenti che si attaccano ai componenti cellulari sono disponibili da tempo. I coloranti fluorescenti possono emettere luce fluorescente dopo l’irradiazione con luce di una certa lunghezza d’onda. Esempi comuni sono Edu, DAPI, PI, FM4-64 e calcofluor white 8,9,10. Uno dei principali svantaggi, tuttavia, è che questi coloranti possono essere tipicamente utilizzati solo in tessuti fissi o per brevi esperimenti, in parte a causa del danno che causano alla cellula 8,9,10.
Con il protocollo presentato qui, i segnali calcofluor sono stabili quando il bianco calcofluor viene miscelato all’interno del mezzo durante gli esperimenti time-lapse nel muschio P. patens. Utilizzando questo metodo, il distacco delle cellule nei mutanti ggb utilizzando l’imaging time-lapse 3D è stato osservato in un periodo di 3 giorni3 (Figura 1). Questo metodo può essere applicato a molti altri sistemi che contengono pareti cellulari e che possono essere colorati dal calcofluor.
Protocol
Representative Results
Discussion
La ricostruzione 3D time-lapse, o imaging 4-D, è un potente strumento per osservare le dinamiche della morfologia cellulare durante i processi di sviluppo. In questo protocollo, mescolando il bianco calcofluor nel mezzo, la dinamica della morfologia cellulare 3D può essere osservata nel muschio P. patens. Usando questo metodo, abbiamo osservato che la superficie delle pareti cellulari nei mutanti ggb viene fatta a pezzi durante lo sviluppo3. Inoltre, il ridotto ispessimento del…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano la dottoressa Soucy Patricia e Betty Nunn dell’Università di Louisville per l’assistenza con il microscopio confocale. Questo lavoro è stato finanziato dalla National Science Foundation (1456884 to M.P.R.) e da un National Science Foundation Cooperative Agreement (1849213 to M.P.R.).
Materials
| 3-mm-thick red plastic light filter | Mitsubishi | no.102 | |
| 27 mm diameter glass base dish | Iwaki | 3930-035 | |
| Agar | Sigma | A6924 | |
| Calcofluor white | Sigma | 18909-100ML-F | Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L |
| Confocal microscope | Nikon | A1 |
NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. |
| Fluorescence microscope | Nikon | TE200 | Equipped with a DS-U3 camera; |
| Gellan gum | Nacali Tesque | 12389-96 | |
| Plant Growth Chambers | SANYO | Sanyo MLR-350H | |
| Sterilized syringe 0.22 μm filter | Millipore | SLGV033RS |
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