Imagerie 3D en accéléré de la dynamique de la paroi cellulaire à l’aide de calcofluor dans les patens de Physcomitrium de mousse
Summary
Ce manuscrit présente un protocole détaillé pour imager la dynamique 3D de la paroi cellulaire du tissu de mousse vivant, permettant la visualisation du détachement des parois cellulaires chez les mutants ggb et l’épaississement des motifs de paroi cellulaire dans le type sauvage au cours du développement sur une longue période.
Abstract
L’imagerie accélérée avec microscopie à fluorescence permet d’observer les changements dynamiques de croissance et de développement aux niveaux cellulaire et subcellulaire. En général, pour les observations sur une longue période, la technique nécessite la transformation d’une protéine fluorescente ; Cependant, pour la plupart des systèmes, la transformation génétique prend du temps ou est techniquement indisponible. Ce manuscrit présente un protocole d’imagerie 3D time-lapse de la dynamique de la paroi cellulaire sur une période de 3 jours à l’aide de colorant calcofluor (qui colore la cellulose dans la paroi cellulaire végétale), développé dans la mousse Physcomitrium patens. Le signal de colorant calcofluor de la paroi cellulaire est stable et peut durer 1 semaine sans décomposition évidente. En utilisant cette méthode, il a été démontré que le détachement des cellules chez les mutants ggb (dans lequel la sous-unité bêta de la protéine géranylgéranyltransférase-I est éliminée) est causé par une expansion cellulaire non régulée et des défauts d’intégrité de la paroi cellulaire. De plus, les modèles de coloration au calcofluor changent avec le temps; Les régions moins intensément colorées sont en corrélation avec les futurs sites d’expansion cellulaire / ramification dans le type sauvage. Cette méthode peut être appliquée à de nombreux autres systèmes qui contiennent des parois cellulaires et qui peuvent être colorés par le calcofluor.
Introduction
Les parois cellulaires végétales subissent des changements dynamiques au cours de l’expansion et du développement cellulaires 1,2,3. Le maintien de l’intégrité de la paroi cellulaire est essentiel pour l’adhésion des cellules végétales pendant la croissance et le développement, ainsi que pour la réponse aux signaux environnementaux. Bien que la visualisation de la dynamique de la paroi cellulaire des cellules vivantes sur une longue période de temps soit essentielle pour comprendre comment l’adhésion cellulaire est maintenue pendant le développement et l’adaptation aux changements environnementaux, les méthodes actuelles d’observation directe de la dynamique de la paroi cellulaire sont encore difficiles.
L’imagerie accélérée des changements cellulaires peut fournir une dynamique de développement informative d’un organisme à l’aide d’un microscope à fluorescence à haute résolution 4,5,6,7. Alors que l’imagerie 3D time-lapse a beaucoup de potentiel pour étudier les changements dynamiques de la forme cellulaire au cours de la croissance et du développement, la technique nécessite normalement la transformation d’une protéine fluorescente 4,5,6,7. Cependant, pour la plupart des systèmes, les transformations génétiques prennent du temps ou sont techniquement difficiles. Comme alternative, les colorants fluorescents qui se fixent aux composants cellulaires sont disponibles depuis longtemps. Les colorants fluorescents peuvent émettre de la lumière fluorescente après irradiation avec de la lumière d’une certaine longueur d’onde. Les exemples courants sont Edu, DAPI, PI, FM4-64 et calcofluor blanc 8,9,10. Un inconvénient majeur, cependant, est que ces colorants ne peuvent généralement être utilisés que dans les tissus fixes ou pour de courtes expériences, en partie à cause des dommages qu’ils causent à la cellule 8,9,10.
Avec le protocole présenté ici, les signaux de calcofluor sont stables lorsque du blanc de calcofluor est mélangé dans le milieu lors d’expériences en accéléré dans la mousse P. patens. En utilisant cette méthode, le détachement des cellules chez les mutants ggb à l’aide de l’imagerie 3D time-lapse a été observé sur une période de 3 jours3 (Figure 1). Cette méthode peut être appliquée à de nombreux autres systèmes qui contiennent des parois cellulaires et qui peuvent être colorés par le calcofluor.
Protocol
Representative Results
Discussion
La reconstruction 3D en accéléré, ou imagerie 4D, est un outil puissant pour observer la dynamique de la morphologie cellulaire au cours des processus de développement. Dans ce protocole, en mélangeant le blanc de calcofluor dans le milieu, la dynamique de la morphologie cellulaire 3D peut être observée dans la mousse P. patens. En utilisant cette méthode, nous avons observé que la surface des parois cellulaires chez les mutants ggb est déchirée au cours du développement3</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient la Dre Soucy Patricia et Betty Nunn de l’Université de Louisville pour leur aide avec le microscope confocal. Ce travail a été financé par la National Science Foundation (1456884 à M.P.R.) et par un accord de coopération de la National Science Foundation (1849213 à M.P.R.).
Materials
| 3-mm-thick red plastic light filter | Mitsubishi | no.102 | |
| 27 mm diameter glass base dish | Iwaki | 3930-035 | |
| Agar | Sigma | A6924 | |
| Calcofluor white | Sigma | 18909-100ML-F | Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L |
| Confocal microscope | Nikon | A1 |
NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. |
| Fluorescence microscope | Nikon | TE200 | Equipped with a DS-U3 camera; |
| Gellan gum | Nacali Tesque | 12389-96 | |
| Plant Growth Chambers | SANYO | Sanyo MLR-350H | |
| Sterilized syringe 0.22 μm filter | Millipore | SLGV033RS |
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