Summary

Конвейер для характеристики структурных пороков сердца у плодной мыши

Published: December 16, 2022
doi:

Summary

В этой статье подробно описываются методы диагностики врожденных пороков сердца у мышей (ИБС) с использованием эхокардиографии плода, некропсии и эпископического флуоресцентного изображения (EFIC) с использованием эпископической конфокальной микроскопии (ECM) с последующей трехмерной (3D) реконструкцией.

Abstract

Врожденные пороки сердца (ИБС) являются основными причинами младенческой смертности в Соединенных Штатах. В 1980-х годах и ранее большинство пациентов с умеренной или тяжелой ИБС умерли до совершеннолетия, с максимальной смертностью в течение первой недели жизни. Замечательные достижения в хирургических методах, диагностических подходах и медицинском управлении привели к заметному улучшению результатов. Для удовлетворения критических исследовательских потребностей в понимании врожденных пороков сердца мышиные модели обеспечили идеальную исследовательскую платформу, поскольку они имеют очень похожую анатомию сердца с людьми и короткие показатели беременности. Сочетание генной инженерии с высокопроизводительными инструментами фенотипирования позволило воспроизвести и диагностировать структурные пороки сердца для дальнейшего выяснения молекулярных путей, стоящих за ИБС. Использование неинвазивной эхокардиографии плода для скрининга сердечных фенотипов в мышиных моделях в сочетании с высокой точностью эпископического флуоресцентного захвата изображения (EFIC) с использованием эпископической конфокальной микроскопии (ECM) гистопатологии с трехмерными (3D) реконструкциями позволяет детально взглянуть на анатомию различных врожденных пороков сердца. Этот протокол описывает полный рабочий процесс этих методов для получения точного диагноза врожденных пороков сердца у мышей. Применение этого протокола фенотипирования к модельным организмам позволит проводить точную диагностику ИБС, давая представление о механизмах ИБС. Выявление основных механизмов ИБС предоставляет возможности для потенциальных методов лечения и вмешательств.

Introduction

Врожденные пороки сердца (ИБС) являются наиболее распространенным врожденным дефектом новорожденных 1,2, затрагивающим около 0,8-1,7% новорожденных и приводящим к значительной неонатальной смертности и заболеваемости3. Генетическая этиология сильно показана при ИБС 4,5. Генетически модифицированные мышиные модели широко использовались для понимания сложности ИБС и механизмов, которые их вызывают из-за того, что мыши имеют четырехкамерные сердца и сопоставимые последовательности ДНК развития сердца у мышей и человеческих плодов6. Идентификация фенотипа мышиных мутантов является фундаментальным первым шагом в характеристике функции гена-мишени. Мышиные модели, выражающие эффекты дозирования генов, в которых одна генетическая мутация может привести к спектру сердечных дефектов, имитирующих ИБС человека, важны для понимания сложности ИБС и механизмов, которые их вызывают.

В этой статье описывается конвейер для характеристики сердечных фенотипов в мышиных моделях. Применяемые методы используют эхокардиограмму плода7, за которой следуют некропсия и гистопатология ECM 7,8, которая может отображать подробную анатомию развивающихся мышиных сердечных фенотипов. Эхокардиограмма плода является неинвазивной модальностью, которая позволяет напрямую визуализировать несколько эмбрионов с разумным разрешением изображения. Кроме того, эхокардиограмма плода обеспечивает быстрое определение общего количества эмбрионов в помете, стадий их развития, а также относительной ориентации и расположения в роге матки. Используя спектральный допплеровский / цветовой поток, аномальные эмбрионы могут быть идентифицированы на основе структуры, гемодинамического нарушения, ограничения роста или развития водянки. Поскольку исследование эхокардиограммы плода является неинвазивным методом, его можно использовать для сканирования в течение нескольких дней и наблюдения за изменениями гемодинамики или морфологии сердца. Получение качественной визуализации эхокардиограмм плода требует практики и мастерства, так как специфические пороки сердца могут быть пропущены из-за отсутствия опыта и знаний. Из-за этого более точный анализ морфологии сердца может быть получен путем сочетания некропсии и гистопатологии ECM. Некропсия обеспечивает прямую визуализацию структуры дуги, относительных отношений аорты и легочной артерии, размера желудочков и предсердий, положения сердца относительно грудной клетки и бронхолегочных структур. Тем не менее, внутренние особенности, такие как сердечные клапаны и толщина стенки, могут быть трудно оценить только с помощью некропсии. Таким образом, Гистопатология ECM рекомендуется для окончательного диагноза. Гистопатология ECM – это метод визуализации с высоким разрешением, который позволяет как 2D, так и 3D-реконструкцию стека изображений9. Эти изображения получаются с помощью последовательной эпископической флуоресцентной визуализации образца, встроенного в парафин, поскольку он тонко секционируется через последовательный интервал автоматическим микротомом. В отличие от классической гистологии, изображения захватываются в виде сечения, прежде чем он будет вырезан из блока, так что все изображения захватываются в одной системе отсчета. Из-за этого стек 2D-изображений, созданный гистопатологией ECM, может быть легко и надежно реконструирован в трех измерениях. Это делается с помощью средства просмотра DICOM, которое позволяет 3D-визуализацию изображений в трех анатомических плоскостях: корональной, сагиттальной и поперечной. Из этих 3D-реконструкций с высоким разрешением может быть поставлен окончательный сердечный диагноз. Применение этих трех различных модальностей визуализации, по отдельности или в комбинации, может обеспечить точную характеристику структурных пороков сердца у эмбрионов мышей.

Protocol

Использование мышей для этих исследований необходимо, так как мыши имеют четырехкамерные сердца, которые могут имитировать человеческие ИБС. Мышам была оказана ветеринарная помощь и размещена в аккредитованном Ассоциацией по оценке и аккредитации лабораторного ухода за животными (AAA…

Representative Results

Эмбрионы мышей со значительными гемодинамическими дефектами были отмечены как эмбриональные летальные. Широкий спектр ИБС может быть идентифицирован с помощью высокопроизводительной, неинвазивной эхокардиограммы плода с использованием различных видов (рисунок 1)….

Discussion

Генетически модифицированные мыши были использованы для понимания патомеханизмов врожденных пороков сердца. Протоколы, которые мы предоставляем в этом исследовании, направлены на оптимизацию и стандартизацию процесса оценки пороков сердца плода мышей. Тем не менее, есть критические…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Никакой.

Materials

1x phosphate-buffered saline solution (PBS), PH7.4 Sigma Aldrich P3813
1.5 mL Eppendorf tubes (or preferred vial for tissue storage) SealRite 1615-5599
10% buffered formalin phosphate solution Fisher Chemical SF100-4
100% Ethanol Decon Laboratories 2701
16% paraformaldehyde (PFA) fixative  ThermoScientific 28908 4% working concentration freshly prepared in 1x PBS at 4 °C
50 mL tubes Falcon 352070
6–12 Well plate or 20 mL vial  for embryo storage Falcon 353046
Dissecting microscope  Leica MDG36
Dissecting Pins (A1 or A2 grade) F.S.T 26002-15
Dissecting Plate  F.S.T FB0875713 Petri dish with paraffin base
Embedding molds Sakura 4133
Extra narrow scissors (10.5 cm) F.S.T 14088-10 1–2 pairs 
Fiji application/Image J NIH Fiji.sc
Fine tip (0.05 mm x 0.01 mm) Dissecting Forceps (11 cm) F.S.T 11252-00 2 Pairs
Hot forceps  F.S.T 11252-00 For orientation of embryos
Industrial Marker for Wax Blocks  Sharpie 2003898 Formatted for labratory use
Jenoptik ProgRes C14plus Microscope Camera  Jenoptik 017953-650-26
Jenoptik ProgRess CapturePro acquisition software Jenoptik jenoptik.com
Large glass beaker  Fisher Scientific S111053 For melting paraffin
Leica M165 FC binocular microscope (16.5:1 zoom optics) Leica M165 FC
OsiriX MD Version 12.0 OsiriX osirix-viewer.com 
Paraplast embedding paraffin wax Millipore Sigma 1003230215
Small glass beaker Fisher Scientific S111045
Small, perforated spoon (14.5 cm) F.S.T 10370-17
Straight Vannas Scissors (4–8 mm) F.S.T 15018-10 A pair
Vevo2100 ultrahigh-frequency ultrasound biomicroscope FUJIFILM VisualSonics Inc. Vevo2100
Xylene Fisher Chemical UN1307

References

  1. Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicine. 99 (23), e20593 (2020).
  2. vander Linde, D., et al. Birth prevalence of congenital heart disease worldwide: a systematic review and meta-analysis). Journal of the American College of Cardiology. 58 (21), 2241-2247 (2011).
  3. Yang, Q., et al. Racial differences in infant mortality attributable to birth defects in the United States. Birth Defects Research. Part A, Clinical and Molecular Teratology. 76 (10), 706-713 (1989).
  4. Patel, A., et al. Prevalence of noncardiac and genetic abnormalities in neonates undergoing cardiac operations: Analysis of the society of thoracic surgeons congenital heart surgery database. The Annals of Thoracic Surgery. 102 (5), 1607-1614 (2016).
  5. Pierpont, M. E., et al. Genetic basis for congenital heart disease: Revisited: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 138 (21), e653-e711 (2018).
  6. Krishnan, A., et al. A detailed comparison of mouse and human cardiac development. Pediatric Research. 76 (6), 500-507 (2014).
  7. Liu, X., et al. Interrogating congenital heart defects with noninvasive fetal echocardiography in a mouse forward genetic screen. Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (1), 31-42 (2014).
  8. Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 99 (2), 93-105 (2013).
  9. Tsuchiya, M., Yamada, S. High-resolution histological 3D-imaging: episcopic fluorescence image capture is widely applied for experimental animals. Congenital Anomalies (Kyoto. 54 (4), 250-251 (2014).
  10. Yu, Q., Tian Leatherbury, ., Lo, X., W, C. Cardiovascular assessment of fetal mice by in utero echocardiography). Ultrasound in Medicine and Biology. 34, 741-752 (2008).
  11. Rosenthal, J., et al. Rapid high resolution three-dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 72 (3), 213-223 (2004).
  12. Weninger, W. J., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nature Genetics. 30 (1), 59-65 (2002).

Play Video

Cite This Article
Guzman-Moreno, C., Zhang, P., Phillips, O. R., Block, M., Glennon, B. J., Holbrook, M., Weigand, L., Lo, C. W., Lin, J. I. A Pipeline to Characterize Structural Heart Defects in the Fetal Mouse. J. Vis. Exp. (190), e64582, doi:10.3791/64582 (2022).

View Video