Un pipeline pour caractériser les malformations cardiaques structurelles chez la souris fœtale
Summary
Cet article détaille les méthodes de diagnostic des cardiopathies congénitales (CHD) murines utilisant l’échocardiographie fœtale, la nécropsie et la capture d’images de fluorescence épiscopique (EFIC) à l’aide de la microscopie confocale épiscopique (ECM) suivie d’une reconstruction tridimensionnelle (3D).
Abstract
Les cardiopathies congénitales (CHD) sont les principales causes de mortalité infantile aux États-Unis. Dans les années 1980 et plus tôt, la plupart des patients atteints de coronaropathie modérée ou sévère mouraient avant l’âge adulte, avec la mortalité maximale au cours de la première semaine de vie. Des progrès remarquables dans les techniques chirurgicales, les approches diagnostiques et la prise en charge médicale ont conduit à des améliorations marquées des résultats. Pour répondre aux besoins de recherche critiques de la compréhension des malformations cardiaques congénitales, les modèles murins ont fourni une plate-forme de recherche idéale, car ils ont une anatomie cardiaque très similaire à celle des humains et des taux de gestation courts. La combinaison du génie génétique avec des outils de phénotypage à haut débit a permis la réplication et le diagnostic des malformations cardiaques structurelles afin d’élucider davantage les voies moléculaires derrière les maladies coronariennes. L’utilisation de l’échocardiographie fœtale non invasive pour dépister les phénotypes cardiaques dans des modèles murins, associée à la haute fidélité de la capture d’images de fluorescence épiscopique (EFIC) à l’aide de l’histopathologie de microscopie confocale épiscopique (ECM) avec reconstructions tridimensionnelles (3D) permet une vue détaillée de l’anatomie de diverses malformations cardiaques congénitales. Ce protocole décrit un flux de travail complet de ces méthodes pour obtenir un diagnostic précis des malformations cardiaques congénitales murines. L’application de ce protocole de phénotypage à des organismes modèles permettra un diagnostic précis de coronaropathie, ce qui permettra de mieux comprendre les mécanismes de la coronaropathie. L’identification des mécanismes sous-jacents de la coronaropathie offre des possibilités de thérapies et d’interventions potentielles.
Introduction
Les cardiopathies congénitales (cardiopathies) sont l’anomalie congénitale néonatale la plus courante 1,2, touchant environ 0,8 % à 1,7 % des nouveau-nés et entraînant une mortalité et une morbidité néonatales importantes3. Une étiologie génétique est fortement indiquée avec les cardiopathies congénitales 4,5. Les modèles murins génétiquement modifiés ont été largement utilisés pour comprendre la complexité des maladies coronariennes et les mécanismes qui les provoquent en raison du fait que les souris ont des cœurs à quatre chambres et des séquences d’ADN de développement cardiaque comparables chez les fœtus de souris et humains6. L’identification du phénotype des mutants de souris est la première étape fondamentale dans la caractérisation de la fonction du gène ciblé. Les modèles murins exprimant les effets de dosage des gènes, dans lesquels une seule mutation génétique peut entraîner un spectre de malformations cardiaques qui imitent les maladies coronariennes humaines, sont importants pour comprendre la complexité des maladies coronariennes et les mécanismes qui les provoquent.
Cet article décrit un pipeline pour caractériser les phénotypes cardiaques dans des modèles murins. Les méthodes appliquées utilisent l’échocardiogramme fœtal 7, suivi de la nécropsie et de l’histopathologie ECM 7,8, qui peut afficher l’anatomie détaillée des phénotypes cardiaques murins en développement. Un échocardiogramme fœtal est une modalité non invasive qui permet la visualisation directe de plusieurs embryons avec une résolution d’imagerie raisonnable. En outre, un échocardiogramme fœtal permet de déterminer rapidement le nombre total d’embryons dans une portée, leurs stades de développement, ainsi que l’orientation et l’emplacement relatifs dans la corne utérine. À l’aide d’un Doppler spectral / flux de couleur, les embryons anormaux peuvent être identifiés en fonction de la structure, de la perturbation hémodynamique, du restriction de croissance ou du développement de l’hydrops. Étant donné qu’une étude d’échocardiogramme fœtal est une technique non invasive, elle peut être utilisée pour scanner sur plusieurs jours et pour observer les changements dans l’hémodynamique ou la morphologie cardiaque. L’obtention d’une imagerie de haute qualité des échocardiogrammes fœtaux nécessite de la pratique et des compétences, car des malformations cardiaques spécifiques peuvent être manquées en raison d’un manque d’expérience et de connaissances. Pour cette raison, une analyse plus définitive de la morphologie cardiaque peut être obtenue par une combinaison de nécropsie et d’histopathologie ECM. L’autopsie permet de visualiser directement la structure de l’arcade, les relations relatives de l’aorte et de l’artère pulmonaire, la taille des ventricules et des oreillettes, la position du cœur par rapport à la poitrine et les structures bronchopulmonaires. Cependant, les caractéristiques intérieures telles que les valves cardiaques et l’épaisseur de la paroi peuvent être difficiles à évaluer par nécropsie seule. Ainsi, l’histopathologie ECM est recommandée pour un diagnostic concluant. L’histopathologie ECM est une technique de visualisation haute résolution qui permet à la fois la reconstruction 2D et 3D de la pile d’images9. Ces images sont obtenues par imagerie fluorescente épiscopique en série d’un échantillon incorporé dans de la paraffine lorsqu’il est sectionné finement à intervalle constant par un microtome automatique. Contrairement à l’histologie classique, les images sont capturées sous forme de section avant d’être découpées du bloc de sorte que toutes les images sont capturées dans le même cadre de référence. Pour cette raison, la pile d’images 2D produite par l’histopathologie ECM peut être facilement et de manière fiable reconstruite en trois dimensions. Cela se fait à l’aide d’une visionneuse DICOM, qui permet la visualisation 3D des images dans les trois plans anatomiques: coronal, sagittal et transversal. À partir de ces reconstructions 3D haute résolution, un diagnostic cardiaque définitif peut être posé. L’application de ces trois différentes modalités de visualisation, individuellement ou en combinaison, peut fournir des caractérisations précises des malformations cardiaques structurelles chez les embryons de souris.
Protocol
Representative Results
Discussion
Des souris génétiquement modifiées ont été utilisées pour comprendre les mécanismes pathologiques des malformations cardiaques congénitales. Les protocoles que nous fournissons dans cette étude tentent de rationaliser et de normaliser le processus d’évaluation des malformations cardiaques fœtales murines. Cependant, il y a des étapes critiques à noter pendant le protocole. Les embryons de souris se développent de manière significative au cours de chaque jour de gestation, et le moment correct pour récol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Aucun.
Materials
| 1x phosphate-buffered saline solution (PBS), PH7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes (or preferred vial for tissue storage) | SealRite | 1615-5599 | |
| 10% buffered formalin phosphate solution | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) fixative | ThermoScientific | 28908 | 4% working concentration freshly prepared in 1x PBS at 4 °C |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| 6–12 Well plate or 20 mL vial for embryo storage | Falcon | 353046 | |
| Dissecting microscope | Leica | MDG36 | |
| Dissecting Pins (A1 or A2 grade) | F.S.T | 26002-15 | |
| Dissecting Plate | F.S.T | FB0875713 | Petri dish with paraffin base |
| Embedding molds | Sakura | 4133 | |
| Extra narrow scissors (10.5 cm) | F.S.T | 14088-10 | 1–2 pairs |
| Fiji application/Image J | NIH | Fiji.sc | |
| Fine tip (0.05 mm x 0.01 mm) Dissecting Forceps (11 cm) | F.S.T | 11252-00 | 2 Pairs |
| Hot forceps | F.S.T | 11252-00 | For orientation of embryos |
| Industrial Marker for Wax Blocks | Sharpie | 2003898 | Formatted for labratory use |
| Jenoptik ProgRes C14plus Microscope Camera | Jenoptik | 017953-650-26 | |
| Jenoptik ProgRess CapturePro acquisition software | Jenoptik | jenoptik.com | |
| Large glass beaker | Fisher Scientific | S111053 | For melting paraffin |
| Leica M165 FC binocular microscope (16.5:1 zoom optics) | Leica | M165 FC | |
| OsiriX MD Version 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
| Paraplast embedding paraffin wax | Millipore Sigma | 1003230215 | |
| Small glass beaker | Fisher Scientific | S111045 | |
| Small, perforated spoon (14.5 cm) | F.S.T | 10370-17 | |
| Straight Vannas Scissors (4–8 mm) | F.S.T | 15018-10 | A pair |
| Vevo2100 ultrahigh-frequency ultrasound biomicroscope | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Xylene | Fisher Chemical | UN1307 |
References
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