Una tubería para caracterizar defectos cardíacos estructurales en el ratón fetal
Summary
Este artículo detalla los métodos de diagnóstico de cardiopatía congénita (CHD) murina mediante ecocardiografía fetal, necropsia y captura de imágenes de fluorescencia episcópica (EFIC) mediante microscopía confocal episcópica (ECM) seguida de reconstrucción tridimensional (3D).
Abstract
Las enfermedades cardíacas congénitas (CHD, por sus siglas en inglés) son las principales causas de muerte infantil en los Estados Unidos. En la década de 1980 y antes, la mayoría de los pacientes con cardiopatía coronaria moderada o grave murieron antes de la edad adulta, con la mortalidad máxima durante la primera semana de vida. Los avances notables en las técnicas quirúrgicas, los enfoques de diagnóstico y el tratamiento médico han llevado a mejoras notables en los resultados. Para abordar las necesidades críticas de investigación para comprender los defectos cardíacos congénitos, los modelos murinos han proporcionado una plataforma de investigación ideal, ya que tienen una anatomía cardíaca muy similar a la de los humanos y tasas de gestación cortas. La combinación de ingeniería genética con herramientas de fenotipado de alto rendimiento ha permitido la replicación y el diagnóstico de defectos cardíacos estructurales para dilucidar aún más las vías moleculares detrás de las CHD. El uso de ecocardiografía fetal no invasiva para detectar los fenotipos cardíacos en modelos de ratón, junto con la alta fidelidad de la captura de imágenes de fluorescencia episcópica (EFIC) utilizando histopatología de microscopía confocal episcópica (ECM) con reconstrucciones tridimensionales (3D) permite una visión detallada de la anatomía de varios defectos cardíacos congénitos. Este protocolo describe un flujo de trabajo completo de estos métodos para obtener un diagnóstico preciso de defectos cardíacos congénitos murinos. La aplicación de este protocolo de fenotipado a organismos modelo permitirá un diagnóstico preciso de CHD, lo que proporcionará información sobre los mecanismos de CHD. La identificación de los mecanismos subyacentes de la cardiopatía coronaria brinda oportunidades para posibles terapias e intervenciones.
Introduction
Las cardiopatías congénitas (CHD) son el defecto congénito neonatal más común 1,2, afectando alrededor del 0,8%-1,7% de los neonatos y resultando en mortalidad y morbilidad neonatal significativa3. Una etiología genética está fuertemente indicada con CHD 4,5. Los modelos de ratón modificados genéticamente se han utilizado ampliamente para comprender la complejidad de las CHD y los mecanismos que las causan debido a que los ratones tienen corazones de cuatro cámaras y secuencias de ADN de desarrollo cardíaco comparables en fetos de ratón y humanos6. La identificación del fenotipo de los mutantes de ratón es el primer paso fundamental para caracterizar la función del gen objetivo. Los modelos de ratón que expresan los efectos de la dosis génica, en los que una sola mutación genética puede dar lugar a un espectro de defectos cardíacos que imitan las CHD humanas, son importantes para comprender la complejidad de las CHD y los mecanismos que las causan.
Este artículo describe una tubería para caracterizar fenotipos cardíacos en modelos de ratón. Los métodos aplicados utilizan el ecocardiograma fetal 7, seguido de la necropsia y la histopatología de la MEC 7,8, que puede mostrar la anatomía detallada del desarrollo de fenotipos cardíacos murinos. Un ecocardiograma fetal es una modalidad no invasiva que permite la visualización directa de múltiples embriones con una resolución de imagen razonable. Además, un ecocardiograma fetal proporciona una determinación rápida del número total de embriones en una camada, sus etapas de desarrollo y la orientación relativa y la ubicación en el cuerno uterino. Usando un flujo espectral Doppler/color, se pueden identificar embriones anormales en función de la estructura, la alteración hemodinámica, la restricción del crecimiento o el desarrollo de hidropesía. Dado que un estudio de ecocardiograma fetal es una técnica no invasiva, se puede utilizar para escanear en varios días y para observar los cambios en la hemodinámica o la morfología cardíaca. La obtención de imágenes de alta calidad de ecocardiogramas fetales requiere práctica y habilidad, ya que los defectos cardíacos específicos pueden pasarse por alto debido a la falta de experiencia y conocimiento. Debido a esto, se puede obtener un análisis más definitivo de la morfología cardíaca a través de una combinación de necropsia e histopatología de la MEC. La necropsia proporciona una visualización directa de la estructura del arco, las relaciones relativas de la aorta y la arteria pulmonar, el tamaño de los ventrículos y las aurículas, la posición del corazón en relación con el tórax y las estructuras broncopulmonares. Sin embargo, las características interiores, como las válvulas cardíacas y el grosor de la pared, pueden ser difíciles de evaluar solo con necropsia. Por lo tanto, se recomienda la histopatología de la ECM para un diagnóstico concluyente. La histopatología ECM es una técnica de visualización de alta resolución que permite la reconstrucción 2D y 3D de la pila de imágenes9. Estas imágenes se obtienen a través de imágenes fluorescentes episcópicas seriadas de una muestra incrustada en parafina, ya que está finamente seccionada a un intervalo constante por un micrótomo automático. A diferencia de la histología clásica, las imágenes se capturan como una sección antes de cortarse del bloque de modo que todas las imágenes se capturan dentro del mismo marco de referencia. Debido a esto, la pila de imágenes 2D producida por la histopatología ECM puede reconstruirse de manera fácil y confiable en tres dimensiones. Esto se hace utilizando un visor DICOM, que permite la visualización 3D de las imágenes en los tres planos anatómicos: coronal, sagital y transversal. A partir de estas reconstrucciones 3D de alta resolución, se puede hacer un diagnóstico cardíaco definitivo. La aplicación de estas tres modalidades de visualización diferentes, ya sea individualmente o en combinación, puede proporcionar caracterizaciones precisas de defectos cardíacos estructurales en embriones de ratón.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se han utilizado ratones modificados genéticamente para comprender los mecanismos patológicos de los defectos cardíacos congénitos. Los protocolos que proporcionamos en este estudio intentan simplificar y estandarizar el proceso de evaluación de los defectos cardíacos fetales murinos. Sin embargo, hay pasos críticos a tener en cuenta durante el protocolo. Los embriones de ratón crecen significativamente durante cada día de gestación, y el momento correcto para cosechar un ratón se puede determinar realizando u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ninguno.
Materials
| 1x phosphate-buffered saline solution (PBS), PH7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes (or preferred vial for tissue storage) | SealRite | 1615-5599 | |
| 10% buffered formalin phosphate solution | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) fixative | ThermoScientific | 28908 | 4% working concentration freshly prepared in 1x PBS at 4 °C |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| 6–12 Well plate or 20 mL vial for embryo storage | Falcon | 353046 | |
| Dissecting microscope | Leica | MDG36 | |
| Dissecting Pins (A1 or A2 grade) | F.S.T | 26002-15 | |
| Dissecting Plate | F.S.T | FB0875713 | Petri dish with paraffin base |
| Embedding molds | Sakura | 4133 | |
| Extra narrow scissors (10.5 cm) | F.S.T | 14088-10 | 1–2 pairs |
| Fiji application/Image J | NIH | Fiji.sc | |
| Fine tip (0.05 mm x 0.01 mm) Dissecting Forceps (11 cm) | F.S.T | 11252-00 | 2 Pairs |
| Hot forceps | F.S.T | 11252-00 | For orientation of embryos |
| Industrial Marker for Wax Blocks | Sharpie | 2003898 | Formatted for labratory use |
| Jenoptik ProgRes C14plus Microscope Camera | Jenoptik | 017953-650-26 | |
| Jenoptik ProgRess CapturePro acquisition software | Jenoptik | jenoptik.com | |
| Large glass beaker | Fisher Scientific | S111053 | For melting paraffin |
| Leica M165 FC binocular microscope (16.5:1 zoom optics) | Leica | M165 FC | |
| OsiriX MD Version 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
| Paraplast embedding paraffin wax | Millipore Sigma | 1003230215 | |
| Small glass beaker | Fisher Scientific | S111045 | |
| Small, perforated spoon (14.5 cm) | F.S.T | 10370-17 | |
| Straight Vannas Scissors (4–8 mm) | F.S.T | 15018-10 | A pair |
| Vevo2100 ultrahigh-frequency ultrasound biomicroscope | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Xylene | Fisher Chemical | UN1307 |
References
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