Fetal Faredeki Yapısal Kalp Kusurlarını Karakterize Etmek İçin Bir Boru Hattı
Summary
Bu makalede fetal ekokardiyografi, nekropsi ve Episkopik floresan görüntü yakalama (EFIC) ve ardından üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyon kullanılarak yapılan murin konjenital kalp hastalığı (KKH) tanı yöntemleri detaylandırılmıştır.
Abstract
Konjenital kalp hastalıkları (KKH) Amerika Birleşik Devletleri’nde bebek ölümlerinin başlıca nedenleridir. 1980’lerde ve daha öncesinde, orta veya şiddetli KKH’li hastaların çoğu, yaşamın ilk haftasında maksimum mortalite ile yetişkinlikten önce öldü. Cerrahi tekniklerdeki, tanısal yaklaşımlardaki ve tıbbi yönetimdeki dikkate değer ilerlemeler, sonuçlarda belirgin iyileşmelere yol açmıştır. Konjenital kalp kusurlarını anlamanın kritik araştırma ihtiyaçlarını karşılamak için, murin modelleri, insanlara çok benzer kalp anatomisine ve kısa gebelik oranlarına sahip oldukları için ideal bir araştırma platformu sağlamıştır. Genetik mühendisliğinin yüksek verimli fenotipleme araçlarıyla kombinasyonu, CHD’lerin arkasındaki moleküler yolları daha da aydınlatmak için yapısal kalp kusurlarının replikasyonuna ve teşhisine izin vermiştir. Fare modellerinde kardiyak fenotipleri taramak için noninvaziv fetal ekokardiyografinin kullanılması, üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyonlarla Piskoposik konfokal mikroskopi (ECM) histopatolojisi kullanılarak Piskoposluk floresan görüntü yakalamanın (EFIC) yüksek doğruluğu ile birleştiğinde, çeşitli konjenital kalp defektlerinin anatomisine ayrıntılı bir bakış açısı sağlar. Bu protokol, murin konjenital kalp kusurlarının doğru bir teşhisini elde etmek için bu yöntemlerin eksiksiz bir iş akışını özetlemektedir. Bu fenotipleme protokolünün organizmaları modellemek için uygulanması, doğru KKH tanısına izin verecek ve KKH’nin mekanizmaları hakkında fikir verecektir. KKH’nin altında yatan mekanizmaların belirlenmesi, potansiyel tedaviler ve müdahaleler için fırsatlar sağlar.
Introduction
Konjenital kalp hastalıkları (KKH) en sık görülen yenidoğan doğum defekti 1,2 olup, yenidoğanların yaklaşık %0,8-%1,7’sini etkileyerek önemli neonatal mortalite ve morbidite ile sonuçlanır 3. Genetik etiyoloji, CHD 4,5 ile güçlü bir şekilde endikedir. Genetiği değiştirilmiş fare modelleri, CHD’lerin karmaşıklığını ve farelerin dört odacıklı kalplere ve fare ve insan fetüslerinde karşılaştırılabilir kardiyak gelişimsel DNA dizilerine sahip olmaları nedeniyle bunlara neden olan mekanizmaları anlamak için yaygın olarak kullanılmıştır6. Fare mutantlarının fenotipini tanımlamak, hedeflenen genin işlevini karakterize etmede temel ilk adımdır. Tek bir genetik mutasyonun insan KKH’lerini taklit eden bir kardiyak defekt spektrumuna neden olabileceği gen dozaj etkilerini ifade eden fare modelleri, KKH’lerin karmaşıklığını ve bunlara neden olan mekanizmaları anlamak için önemlidir.
Bu makalede, fare modellerinde kardiyak fenotipleri karakterize etmek için bir boru hattı özetlenmektedir. Uygulanan yöntemlerde fetal ekokardiyogram 7, ardından gelişen murin kardiyak fenotiplerinin ayrıntılı anatomisini gösterebilen nekropsi ve ECM histopatolojisi 7,8 kullanılmaktadır. Fetal ekokardiyografi, makul görüntüleme çözünürlüğü ile çoklu embriyoların doğrudan görüntülenmesini sağlayan noninvaziv bir modalitedir. Ek olarak, bir fetal ekokardiyogram, bir çöpteki toplam embriyo sayısının, gelişim aşamalarının ve uterus boynuzundaki göreceli oryantasyonun ve yerin hızlı bir şekilde belirlenmesini sağlar. Spektral Doppler/renk akışı kullanılarak anormal embriyolar yapıya, hemodinamik bozulmaya, büyüme kısıtlamasına veya hidrops gelişimine bağlı olarak tanımlanabilir. Fetal ekokardiyogram çalışması noninvaziv bir teknik olduğundan, birden fazla günde tarama yapmak ve hemodinamik veya kardiyak morfolojideki değişiklikleri gözlemlemek için kullanılabilir. Fetal ekokardiyogramların yüksek kaliteli görüntülenmesi pratik ve beceri gerektirir, çünkü deneyim ve bilgi eksikliği nedeniyle spesifik kalp kusurları gözden kaçırılabilir. Bu nedenle, nekropsi ve ECM histopatolojisinin bir kombinasyonu ile kardiyak morfolojinin daha kesin bir analizi elde edilebilir. Nekropsi, ark yapısının, aort ve pulmoner arterin göreceli ilişkilerinin, ventriküllerin ve atriyumun büyüklüğünün, kalbin göğse göre konumunun ve bronkopulmoner yapıların doğrudan görselleştirilmesini sağlar. Bununla birlikte, kalp kapakçıkları ve duvar kalınlığı gibi iç özelliklerin tek başına nekropsi ile değerlendirilmesi zor olabilir. Bu nedenle, kesin bir tanı için ECM histopatolojisi önerilir. ECM histopatolojisi, görüntü yığını9’un hem 2B hem de 3B rekonstrüksiyonuna izin veren yüksek çözünürlüklü bir görselleştirme tekniğidir. Bu görüntüler, parafine gömülü bir numunenin seri Episkopik floresan görüntülemesi yoluyla, otomatik bir mikrotom tarafından tutarlı bir aralıkta ince bir şekilde kesitlendiği için elde edilir. Klasik histolojiden farklı olarak, görüntüler bloktan kesilmeden önce bir bölüm olarak yakalanır, böylece tüm görüntüler aynı referans çerçevesi içinde yakalanır. Bu nedenle, ECM histopatolojisi tarafından üretilen 2D görüntü yığını üç boyutlu olarak kolayca ve güvenilir bir şekilde yeniden yapılandırılabilir. Bu, üç anatomik düzlemdeki görüntülerin 3D görselleştirilmesine izin veren bir DICOM görüntüleyici kullanılarak yapılır: koronal, sagital ve enine. Bu yüksek çözünürlüklü 3D rekonstrüksiyonlardan kesin bir kardiyak tanı konulabilir. Bu üç farklı görselleştirme yönteminin ayrı ayrı veya kombinasyon halinde uygulanması, fare embriyolarındaki yapısal kalp defektlerinin doğru karakterizasyonunu sağlayabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Genetiği değiştirilmiş fareler, konjenital kalp defektlerinin patomekanizmalarını anlamak için kullanılmıştır. Bu çalışmada sunduğumuz protokoller, murin fetal kalp defektlerini değerlendirme sürecini kolaylaştırmaya ve standartlaştırmaya çalışmaktadır. Ancak, protokol sırasında dikkat edilmesi gereken kritik adımlar vardır. Fare embriyoları gebeliğin her gününde önemli ölçüde büyür ve bir fareyi hasat etmek için doğru zaman, fetal ekokardiyogramın doğru bir şekilde yapılması…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hiç kimse.
Materials
| 1x phosphate-buffered saline solution (PBS), PH7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes (or preferred vial for tissue storage) | SealRite | 1615-5599 | |
| 10% buffered formalin phosphate solution | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) fixative | ThermoScientific | 28908 | 4% working concentration freshly prepared in 1x PBS at 4 °C |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| 6–12 Well plate or 20 mL vial for embryo storage | Falcon | 353046 | |
| Dissecting microscope | Leica | MDG36 | |
| Dissecting Pins (A1 or A2 grade) | F.S.T | 26002-15 | |
| Dissecting Plate | F.S.T | FB0875713 | Petri dish with paraffin base |
| Embedding molds | Sakura | 4133 | |
| Extra narrow scissors (10.5 cm) | F.S.T | 14088-10 | 1–2 pairs |
| Fiji application/Image J | NIH | Fiji.sc | |
| Fine tip (0.05 mm x 0.01 mm) Dissecting Forceps (11 cm) | F.S.T | 11252-00 | 2 Pairs |
| Hot forceps | F.S.T | 11252-00 | For orientation of embryos |
| Industrial Marker for Wax Blocks | Sharpie | 2003898 | Formatted for labratory use |
| Jenoptik ProgRes C14plus Microscope Camera | Jenoptik | 017953-650-26 | |
| Jenoptik ProgRess CapturePro acquisition software | Jenoptik | jenoptik.com | |
| Large glass beaker | Fisher Scientific | S111053 | For melting paraffin |
| Leica M165 FC binocular microscope (16.5:1 zoom optics) | Leica | M165 FC | |
| OsiriX MD Version 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
| Paraplast embedding paraffin wax | Millipore Sigma | 1003230215 | |
| Small glass beaker | Fisher Scientific | S111045 | |
| Small, perforated spoon (14.5 cm) | F.S.T | 10370-17 | |
| Straight Vannas Scissors (4–8 mm) | F.S.T | 15018-10 | A pair |
| Vevo2100 ultrahigh-frequency ultrasound biomicroscope | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Xylene | Fisher Chemical | UN1307 |
References
- Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicine. 99 (23), e20593 (2020).
- vander Linde, D., et al. Birth prevalence of congenital heart disease worldwide: a systematic review and meta-analysis). Journal of the American College of Cardiology. 58 (21), 2241-2247 (2011).
- Yang, Q., et al. Racial differences in infant mortality attributable to birth defects in the United States. Birth Defects Research. Part A, Clinical and Molecular Teratology. 76 (10), 706-713 (1989).
- Patel, A., et al. Prevalence of noncardiac and genetic abnormalities in neonates undergoing cardiac operations: Analysis of the society of thoracic surgeons congenital heart surgery database. The Annals of Thoracic Surgery. 102 (5), 1607-1614 (2016).
- Pierpont, M. E., et al. Genetic basis for congenital heart disease: Revisited: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 138 (21), e653-e711 (2018).
- Krishnan, A., et al. A detailed comparison of mouse and human cardiac development. Pediatric Research. 76 (6), 500-507 (2014).
- Liu, X., et al. Interrogating congenital heart defects with noninvasive fetal echocardiography in a mouse forward genetic screen. Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (1), 31-42 (2014).
- Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 99 (2), 93-105 (2013).
- Tsuchiya, M., Yamada, S. High-resolution histological 3D-imaging: episcopic fluorescence image capture is widely applied for experimental animals. Congenital Anomalies (Kyoto. 54 (4), 250-251 (2014).
- Yu, Q., Tian Leatherbury, ., Lo, X., W, C. Cardiovascular assessment of fetal mice by in utero echocardiography). Ultrasound in Medicine and Biology. 34, 741-752 (2008).
- Rosenthal, J., et al. Rapid high resolution three-dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 72 (3), 213-223 (2004).
- Weninger, W. J., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nature Genetics. 30 (1), 59-65 (2002).
