Summary

Fetal Faredeki Yapısal Kalp Kusurlarını Karakterize Etmek İçin Bir Boru Hattı

Published: December 16, 2022
doi:

Summary

Bu makalede fetal ekokardiyografi, nekropsi ve Episkopik floresan görüntü yakalama (EFIC) ve ardından üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyon kullanılarak yapılan murin konjenital kalp hastalığı (KKH) tanı yöntemleri detaylandırılmıştır.

Abstract

Konjenital kalp hastalıkları (KKH) Amerika Birleşik Devletleri’nde bebek ölümlerinin başlıca nedenleridir. 1980’lerde ve daha öncesinde, orta veya şiddetli KKH’li hastaların çoğu, yaşamın ilk haftasında maksimum mortalite ile yetişkinlikten önce öldü. Cerrahi tekniklerdeki, tanısal yaklaşımlardaki ve tıbbi yönetimdeki dikkate değer ilerlemeler, sonuçlarda belirgin iyileşmelere yol açmıştır. Konjenital kalp kusurlarını anlamanın kritik araştırma ihtiyaçlarını karşılamak için, murin modelleri, insanlara çok benzer kalp anatomisine ve kısa gebelik oranlarına sahip oldukları için ideal bir araştırma platformu sağlamıştır. Genetik mühendisliğinin yüksek verimli fenotipleme araçlarıyla kombinasyonu, CHD’lerin arkasındaki moleküler yolları daha da aydınlatmak için yapısal kalp kusurlarının replikasyonuna ve teşhisine izin vermiştir. Fare modellerinde kardiyak fenotipleri taramak için noninvaziv fetal ekokardiyografinin kullanılması, üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyonlarla Piskoposik konfokal mikroskopi (ECM) histopatolojisi kullanılarak Piskoposluk floresan görüntü yakalamanın (EFIC) yüksek doğruluğu ile birleştiğinde, çeşitli konjenital kalp defektlerinin anatomisine ayrıntılı bir bakış açısı sağlar. Bu protokol, murin konjenital kalp kusurlarının doğru bir teşhisini elde etmek için bu yöntemlerin eksiksiz bir iş akışını özetlemektedir. Bu fenotipleme protokolünün organizmaları modellemek için uygulanması, doğru KKH tanısına izin verecek ve KKH’nin mekanizmaları hakkında fikir verecektir. KKH’nin altında yatan mekanizmaların belirlenmesi, potansiyel tedaviler ve müdahaleler için fırsatlar sağlar.

Introduction

Konjenital kalp hastalıkları (KKH) en sık görülen yenidoğan doğum defekti 1,2 olup, yenidoğanların yaklaşık %0,8-%1,7’sini etkileyerek önemli neonatal mortalite ve morbidite ile sonuçlanır 3. Genetik etiyoloji, CHD 4,5 ile güçlü bir şekilde endikedir. Genetiği değiştirilmiş fare modelleri, CHD’lerin karmaşıklığını ve farelerin dört odacıklı kalplere ve fare ve insan fetüslerinde karşılaştırılabilir kardiyak gelişimsel DNA dizilerine sahip olmaları nedeniyle bunlara neden olan mekanizmaları anlamak için yaygın olarak kullanılmıştır6. Fare mutantlarının fenotipini tanımlamak, hedeflenen genin işlevini karakterize etmede temel ilk adımdır. Tek bir genetik mutasyonun insan KKH’lerini taklit eden bir kardiyak defekt spektrumuna neden olabileceği gen dozaj etkilerini ifade eden fare modelleri, KKH’lerin karmaşıklığını ve bunlara neden olan mekanizmaları anlamak için önemlidir.

Bu makalede, fare modellerinde kardiyak fenotipleri karakterize etmek için bir boru hattı özetlenmektedir. Uygulanan yöntemlerde fetal ekokardiyogram 7, ardından gelişen murin kardiyak fenotiplerinin ayrıntılı anatomisini gösterebilen nekropsi ve ECM histopatolojisi 7,8 kullanılmaktadır. Fetal ekokardiyografi, makul görüntüleme çözünürlüğü ile çoklu embriyoların doğrudan görüntülenmesini sağlayan noninvaziv bir modalitedir. Ek olarak, bir fetal ekokardiyogram, bir çöpteki toplam embriyo sayısının, gelişim aşamalarının ve uterus boynuzundaki göreceli oryantasyonun ve yerin hızlı bir şekilde belirlenmesini sağlar. Spektral Doppler/renk akışı kullanılarak anormal embriyolar yapıya, hemodinamik bozulmaya, büyüme kısıtlamasına veya hidrops gelişimine bağlı olarak tanımlanabilir. Fetal ekokardiyogram çalışması noninvaziv bir teknik olduğundan, birden fazla günde tarama yapmak ve hemodinamik veya kardiyak morfolojideki değişiklikleri gözlemlemek için kullanılabilir. Fetal ekokardiyogramların yüksek kaliteli görüntülenmesi pratik ve beceri gerektirir, çünkü deneyim ve bilgi eksikliği nedeniyle spesifik kalp kusurları gözden kaçırılabilir. Bu nedenle, nekropsi ve ECM histopatolojisinin bir kombinasyonu ile kardiyak morfolojinin daha kesin bir analizi elde edilebilir. Nekropsi, ark yapısının, aort ve pulmoner arterin göreceli ilişkilerinin, ventriküllerin ve atriyumun büyüklüğünün, kalbin göğse göre konumunun ve bronkopulmoner yapıların doğrudan görselleştirilmesini sağlar. Bununla birlikte, kalp kapakçıkları ve duvar kalınlığı gibi iç özelliklerin tek başına nekropsi ile değerlendirilmesi zor olabilir. Bu nedenle, kesin bir tanı için ECM histopatolojisi önerilir. ECM histopatolojisi, görüntü yığını9’un hem 2B hem de 3B rekonstrüksiyonuna izin veren yüksek çözünürlüklü bir görselleştirme tekniğidir. Bu görüntüler, parafine gömülü bir numunenin seri Episkopik floresan görüntülemesi yoluyla, otomatik bir mikrotom tarafından tutarlı bir aralıkta ince bir şekilde kesitlendiği için elde edilir. Klasik histolojiden farklı olarak, görüntüler bloktan kesilmeden önce bir bölüm olarak yakalanır, böylece tüm görüntüler aynı referans çerçevesi içinde yakalanır. Bu nedenle, ECM histopatolojisi tarafından üretilen 2D görüntü yığını üç boyutlu olarak kolayca ve güvenilir bir şekilde yeniden yapılandırılabilir. Bu, üç anatomik düzlemdeki görüntülerin 3D görselleştirilmesine izin veren bir DICOM görüntüleyici kullanılarak yapılır: koronal, sagital ve enine. Bu yüksek çözünürlüklü 3D rekonstrüksiyonlardan kesin bir kardiyak tanı konulabilir. Bu üç farklı görselleştirme yönteminin ayrı ayrı veya kombinasyon halinde uygulanması, fare embriyolarındaki yapısal kalp defektlerinin doğru karakterizasyonunu sağlayabilir.

Protocol

Bu çalışmalar için farelerin kullanılması, farelerin insan KKH’lerini taklit edebilen dört odacıklı kalplere sahip olmaları nedeniyle gereklidir. Farelere veteriner bakımı sağlanmış ve kurumun Laboratuvar Hayvan Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği (AAALAC) tarafından akredite edilmiş hayvan bakım tesisinde barındırılmıştır. Farelerin rahatsızlığını, stresini, ağrısını ve yaralanmasını en aza indirmek için sıkı protokoller izlendi. Fareler, Amerikan Veteriner Hekimleri Bi…

Representative Results

Önemli hemodinamik defektlere sahip fare embriyolarının embriyonik ölümcül olduğu kaydedildi. Çok çeşitli KKH’ler, farklı görüşler kullanılarak yüksek çıkışlı, noninvaziv fetal ekokardiyogram ile tanımlanabilir (Şekil 1). Septal defektler: En sık görülen KKH’ler ventriküler septal defekt (VSD), atriyoventriküler septal defekt (AVSD) ve atriyal septal defekt (ASD)1 gibi septal defektlerdir. VSD ve…

Discussion

Genetiği değiştirilmiş fareler, konjenital kalp defektlerinin patomekanizmalarını anlamak için kullanılmıştır. Bu çalışmada sunduğumuz protokoller, murin fetal kalp defektlerini değerlendirme sürecini kolaylaştırmaya ve standartlaştırmaya çalışmaktadır. Ancak, protokol sırasında dikkat edilmesi gereken kritik adımlar vardır. Fare embriyoları gebeliğin her gününde önemli ölçüde büyür ve bir fareyi hasat etmek için doğru zaman, fetal ekokardiyogramın doğru bir şekilde yapılması…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Hiç kimse.

Materials

1x phosphate-buffered saline solution (PBS), PH7.4 Sigma Aldrich P3813
1.5 mL Eppendorf tubes (or preferred vial for tissue storage) SealRite 1615-5599
10% buffered formalin phosphate solution Fisher Chemical SF100-4
100% Ethanol Decon Laboratories 2701
16% paraformaldehyde (PFA) fixative  ThermoScientific 28908 4% working concentration freshly prepared in 1x PBS at 4 °C
50 mL tubes Falcon 352070
6–12 Well plate or 20 mL vial  for embryo storage Falcon 353046
Dissecting microscope  Leica MDG36
Dissecting Pins (A1 or A2 grade) F.S.T 26002-15
Dissecting Plate  F.S.T FB0875713 Petri dish with paraffin base
Embedding molds Sakura 4133
Extra narrow scissors (10.5 cm) F.S.T 14088-10 1–2 pairs 
Fiji application/Image J NIH Fiji.sc
Fine tip (0.05 mm x 0.01 mm) Dissecting Forceps (11 cm) F.S.T 11252-00 2 Pairs
Hot forceps  F.S.T 11252-00 For orientation of embryos
Industrial Marker for Wax Blocks  Sharpie 2003898 Formatted for labratory use
Jenoptik ProgRes C14plus Microscope Camera  Jenoptik 017953-650-26
Jenoptik ProgRess CapturePro acquisition software Jenoptik jenoptik.com
Large glass beaker  Fisher Scientific S111053 For melting paraffin
Leica M165 FC binocular microscope (16.5:1 zoom optics) Leica M165 FC
OsiriX MD Version 12.0 OsiriX osirix-viewer.com 
Paraplast embedding paraffin wax Millipore Sigma 1003230215
Small glass beaker Fisher Scientific S111045
Small, perforated spoon (14.5 cm) F.S.T 10370-17
Straight Vannas Scissors (4–8 mm) F.S.T 15018-10 A pair
Vevo2100 ultrahigh-frequency ultrasound biomicroscope FUJIFILM VisualSonics Inc. Vevo2100
Xylene Fisher Chemical UN1307

References

  1. Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicine. 99 (23), e20593 (2020).
  2. vander Linde, D., et al. Birth prevalence of congenital heart disease worldwide: a systematic review and meta-analysis). Journal of the American College of Cardiology. 58 (21), 2241-2247 (2011).
  3. Yang, Q., et al. Racial differences in infant mortality attributable to birth defects in the United States. Birth Defects Research. Part A, Clinical and Molecular Teratology. 76 (10), 706-713 (1989).
  4. Patel, A., et al. Prevalence of noncardiac and genetic abnormalities in neonates undergoing cardiac operations: Analysis of the society of thoracic surgeons congenital heart surgery database. The Annals of Thoracic Surgery. 102 (5), 1607-1614 (2016).
  5. Pierpont, M. E., et al. Genetic basis for congenital heart disease: Revisited: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 138 (21), e653-e711 (2018).
  6. Krishnan, A., et al. A detailed comparison of mouse and human cardiac development. Pediatric Research. 76 (6), 500-507 (2014).
  7. Liu, X., et al. Interrogating congenital heart defects with noninvasive fetal echocardiography in a mouse forward genetic screen. Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (1), 31-42 (2014).
  8. Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 99 (2), 93-105 (2013).
  9. Tsuchiya, M., Yamada, S. High-resolution histological 3D-imaging: episcopic fluorescence image capture is widely applied for experimental animals. Congenital Anomalies (Kyoto. 54 (4), 250-251 (2014).
  10. Yu, Q., Tian Leatherbury, ., Lo, X., W, C. Cardiovascular assessment of fetal mice by in utero echocardiography). Ultrasound in Medicine and Biology. 34, 741-752 (2008).
  11. Rosenthal, J., et al. Rapid high resolution three-dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 72 (3), 213-223 (2004).
  12. Weninger, W. J., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nature Genetics. 30 (1), 59-65 (2002).

Play Video

Cite This Article
Guzman-Moreno, C., Zhang, P., Phillips, O. R., Block, M., Glennon, B. J., Holbrook, M., Weigand, L., Lo, C. W., Lin, J. I. A Pipeline to Characterize Structural Heart Defects in the Fetal Mouse. J. Vis. Exp. (190), e64582, doi:10.3791/64582 (2022).

View Video