خط أنابيب لتوصيف عيوب القلب الهيكلية في الفأر الجنيني
Summary
توضح هذه المقالة تفاصيل طرق تشخيص أمراض القلب الخلقية للفئران (CHD) باستخدام تخطيط صدى القلب الجنيني ، والتشريح ، والتقاط الصور الفلورية الأسقفية (EFIC) باستخدام المجهر الأسقفي متحد البؤر (ECM) متبوعا بإعادة البناء ثلاثي الأبعاد (3D).
Abstract
أمراض القلب الخلقية (CHDs) هي الأسباب الرئيسية لوفاة الرضع في الولايات المتحدة. في 1980s وما قبلها ، توفي معظم المرضى الذين يعانون من أمراض القلب التاجية المعتدلة أو الشديدة قبل سن الرشد ، مع الحد الأقصى للوفيات خلال الأسبوع الأول من الحياة. أدت التطورات الملحوظة في التقنيات الجراحية وأساليب التشخيص والإدارة الطبية إلى تحسينات ملحوظة في النتائج. لتلبية الاحتياجات البحثية الحرجة لفهم عيوب القلب الخلقية ، قدمت نماذج الفئران منصة بحث مثالية ، حيث أن لديها تشريح قلب مشابه جدا للبشر ومعدلات حمل قصيرة. سمح الجمع بين الهندسة الوراثية وأدوات التنميط الظاهري عالية الإنتاجية بتكرار وتشخيص عيوب القلب الهيكلية لزيادة توضيح المسارات الجزيئية وراء أمراض القلب التاجية. يتيح استخدام تخطيط صدى القلب الجنيني غير الباضع لفحص الأنماط الظاهرية للقلب في نماذج الفئران إلى جانب الدقة العالية لالتقاط الصور الفلورية الأسقفية (EFIC) باستخدام الفحص المجهري الأسقفي متحد البؤر (ECM) التشريح المرضي مع إعادة البناء ثلاثي الأبعاد (3D) عرض مفصل لتشريح عيوب القلب الخلقية المختلفة. يحدد هذا البروتوكول سير عمل كامل لهذه الطرق للحصول على تشخيص دقيق لعيوب القلب الخلقية للفئران. سيسمح تطبيق بروتوكول التنميط الظاهري هذا على الكائنات الحية النموذجية بالتشخيص الدقيق لأمراض الشرايين التاجية ، مما يؤدي إلى إلقاء نظرة ثاقبة على آليات أمراض الشرايين التاجية. يوفر تحديد الآليات الأساسية لأمراض القلب التاجية فرصا للعلاجات والتدخلات المحتملة.
Introduction
أمراض القلب الخلقية (CHDs) هي أكثر العيوب الخلقية الوليدية شيوعا 1,2 ، حيث تؤثر على حوالي 0.8٪ –1.7٪ من حديثي الولادة وتؤدي إلى وفيات ومراضة كبيرة لحديثي الولادة3. يشار بقوة إلى المسببات الوراثية مع CHDs 4,5. تم استخدام نماذج الفئران المعدلة وراثيا على نطاق واسع لفهم تعقيد أمراض الشرايين التاجية والآليات التي تسببها بسبب الفئران التي لديها قلوب من أربع غرف وتسلسل الحمض النووي التنموي القلبي المماثل في الفئران والأجنة البشرية6. يعد تحديد النمط الظاهري لمتحولات الفئران الخطوة الأولى الأساسية في توصيف وظيفة الجين المستهدف. تعد نماذج الفئران التي تعبر عن تأثيرات جرعة الجينات ، والتي يمكن أن تؤدي فيها طفرة جينية واحدة إلى مجموعة من العيوب القلبية التي تحاكي أمراض الشرايين التاجية البشرية ، مهمة لفهم تعقيد أمراض القلب التاجية والآليات التي تسببها.
توضح هذه المقالة خط أنابيب لتوصيف الأنماط الظاهرية القلبية في نماذج الفئران. تستخدم الطرق المطبقة مخطط صدى القلبالجنيني 7 ، يليه التشريح وعلم أمراض الأنسجةECM 7,8 ، والذي يمكن أن يعرض التشريح التفصيلي لتطوير الأنماط الظاهرية لقلب الفئران. مخطط صدى القلب الجنيني هو طريقة غير جراحية تسمح بالتصور المباشر لأجنة متعددة بدقة تصوير معقولة. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر مخطط صدى القلب الجنيني تحديدا سريعا للعدد الإجمالي للأجنة في القمامة ، ومراحل نموها ، والاتجاه النسبي والموقع في قرن الرحم. باستخدام تدفق دوبلر / اللون الطيفي ، يمكن تحديد الأجنة غير الطبيعية بناء على الهيكل أو اضطراب الدورة الدموية أو تقييد النمو أو تطور الهيدروبس. نظرا لأن دراسة مخطط صدى القلب للجنين هي تقنية غير جراحية ، فيمكن استخدامها للمسح في عدة أيام ومراقبة التغيرات في ديناميكا الدم أو مورفولوجيا القلب. يتطلب الحصول على تصوير عالي الجودة لتخطيط صدى القلب الجنيني ممارسة ومهارة ، حيث قد يتم تفويت عيوب معينة في القلب بسبب نقص الخبرة والمعرفة. لهذا السبب ، يمكن الحصول على تحليل أكثر تحديدا لمورفولوجيا القلب من خلال مزيج من التشريح وعلم أمراض الأنسجة ECM. يوفر التشريح تصورا مباشرا لبنية القوس ، والعلاقات النسبية للشريان الأورطي والشريان الرئوي ، وحجم البطينين والأذينين ، وموضع القلب بالنسبة للصدر ، والهياكل القصبية الرئوية. ومع ذلك ، قد يكون من الصعب تقييم الميزات الداخلية مثل صمامات القلب وسمك الجدار من خلال التشريح وحده. وبالتالي ، يوصى بعلم أمراض الأنسجة ECM لتشخيص قاطع. ECM التشريح المرضي هو تقنية تصور عالية الدقة تسمح بإعادة بناء كل من 2D و 3D لمكدس الصور9. يتم الحصول على هذه الصور من خلال التصوير الفلوري الأسقفي التسلسلي لعينة مدمجة بالبارافين حيث يتم تقسيمها بشكل رقيق في فاصل زمني ثابت بواسطة ميكروتوم تلقائي. على عكس الأنسجة الكلاسيكية ، يتم التقاط الصور كقسم قبل قطعها من الكتلة بحيث يتم التقاط جميع الصور داخل نفس الإطار المرجعي. لهذا السبب ، يمكن إعادة بناء مكدس الصور 2D الذي تنتجه ECM التشريح المرضي بسهولة وموثوقية في ثلاثة أبعاد. يتم ذلك باستخدام عارض DICOM ، والذي يسمح بتصور 3D للصور في المستويات التشريحية الثلاثة: الإكليلية والسهمية والمستعرضة. من عمليات إعادة البناء 3D عالية الدقة هذه ، يمكن إجراء تشخيص نهائي للقلب. يمكن أن يوفر تطبيق طرق التصور الثلاثة المختلفة هذه ، إما بشكل فردي أو مجتمعة ، توصيفات دقيقة لعيوب القلب الهيكلية في أجنة الفئران.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم استخدام الفئران المعدلة وراثيا لفهم الآليات المرضية لعيوب القلب الخلقية. تحاول البروتوكولات التي نقدمها في هذه الدراسة تبسيط وتوحيد عملية تقييم عيوب قلب الجنين الفئران. ومع ذلك ، هناك خطوات مهمة يجب ملاحظتها أثناء البروتوكول. تنمو أجنة الفئران بشكل ملحوظ خلال كل يوم من أيام الحمل ، وي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
اي.
Materials
| 1x phosphate-buffered saline solution (PBS), PH7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes (or preferred vial for tissue storage) | SealRite | 1615-5599 | |
| 10% buffered formalin phosphate solution | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) fixative | ThermoScientific | 28908 | 4% working concentration freshly prepared in 1x PBS at 4 °C |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| 6–12 Well plate or 20 mL vial for embryo storage | Falcon | 353046 | |
| Dissecting microscope | Leica | MDG36 | |
| Dissecting Pins (A1 or A2 grade) | F.S.T | 26002-15 | |
| Dissecting Plate | F.S.T | FB0875713 | Petri dish with paraffin base |
| Embedding molds | Sakura | 4133 | |
| Extra narrow scissors (10.5 cm) | F.S.T | 14088-10 | 1–2 pairs |
| Fiji application/Image J | NIH | Fiji.sc | |
| Fine tip (0.05 mm x 0.01 mm) Dissecting Forceps (11 cm) | F.S.T | 11252-00 | 2 Pairs |
| Hot forceps | F.S.T | 11252-00 | For orientation of embryos |
| Industrial Marker for Wax Blocks | Sharpie | 2003898 | Formatted for labratory use |
| Jenoptik ProgRes C14plus Microscope Camera | Jenoptik | 017953-650-26 | |
| Jenoptik ProgRess CapturePro acquisition software | Jenoptik | jenoptik.com | |
| Large glass beaker | Fisher Scientific | S111053 | For melting paraffin |
| Leica M165 FC binocular microscope (16.5:1 zoom optics) | Leica | M165 FC | |
| OsiriX MD Version 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
| Paraplast embedding paraffin wax | Millipore Sigma | 1003230215 | |
| Small glass beaker | Fisher Scientific | S111045 | |
| Small, perforated spoon (14.5 cm) | F.S.T | 10370-17 | |
| Straight Vannas Scissors (4–8 mm) | F.S.T | 15018-10 | A pair |
| Vevo2100 ultrahigh-frequency ultrasound biomicroscope | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Xylene | Fisher Chemical | UN1307 |
References
- Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicine. 99 (23), e20593 (2020).
- vander Linde, D., et al. Birth prevalence of congenital heart disease worldwide: a systematic review and meta-analysis). Journal of the American College of Cardiology. 58 (21), 2241-2247 (2011).
- Yang, Q., et al. Racial differences in infant mortality attributable to birth defects in the United States. Birth Defects Research. Part A, Clinical and Molecular Teratology. 76 (10), 706-713 (1989).
- Patel, A., et al. Prevalence of noncardiac and genetic abnormalities in neonates undergoing cardiac operations: Analysis of the society of thoracic surgeons congenital heart surgery database. The Annals of Thoracic Surgery. 102 (5), 1607-1614 (2016).
- Pierpont, M. E., et al. Genetic basis for congenital heart disease: Revisited: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 138 (21), e653-e711 (2018).
- Krishnan, A., et al. A detailed comparison of mouse and human cardiac development. Pediatric Research. 76 (6), 500-507 (2014).
- Liu, X., et al. Interrogating congenital heart defects with noninvasive fetal echocardiography in a mouse forward genetic screen. Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (1), 31-42 (2014).
- Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 99 (2), 93-105 (2013).
- Tsuchiya, M., Yamada, S. High-resolution histological 3D-imaging: episcopic fluorescence image capture is widely applied for experimental animals. Congenital Anomalies (Kyoto. 54 (4), 250-251 (2014).
- Yu, Q., Tian Leatherbury, ., Lo, X., W, C. Cardiovascular assessment of fetal mice by in utero echocardiography). Ultrasound in Medicine and Biology. 34, 741-752 (2008).
- Rosenthal, J., et al. Rapid high resolution three-dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 72 (3), 213-223 (2004).
- Weninger, W. J., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nature Genetics. 30 (1), 59-65 (2002).
