Virusvoortplanting en celgebaseerde colorimetrische kwantificering
Summary
Het huidige protocol beschrijft de verspreiding van het Zika-virus (ZIKV) in niercellen van Vero Afrikaanse groene apen en de kwantificering van ZIKV met behulp van celgebaseerde colorimetrische immunodetectiemethoden in formaten met 24 wells en 96 wells (hoge doorvoer).
Abstract
Zikavirus (ZIKV) is een door muggen overgedragen virus dat behoort tot het geslacht Flavivirus. ZIKV-infectie is in verband gebracht met aangeboren hersenafwijkingen en mogelijk syndroom van Guillain-Barré bij volwassenen. Onderzoek naar ZIKV om de ziektemechanismen te begrijpen is belangrijk om de ontwikkeling van vaccins en behandelingen te vergemakkelijken. De methode om virussen te kwantificeren is cruciaal en fundamenteel op het gebied van virologie. De focusvormende test (FFA) is een viruskwantificeringstest die het virale antigeen met antilichamen detecteert en de infectiehaarden van cellen identificeert met behulp van de peroxidase-immunokleuringstechniek. De huidige studie beschrijft het protocol voor virusvoortplanting en -kwantificering met behulp van zowel 24-wells als 96-wells (high throughput) formaten. In vergelijking met andere vergelijkbare onderzoeken heeft dit protocol de optimalisatie van de foci-grootte verder beschreven, wat als leidraad kan dienen om het gebruik van deze test voor andere virussen uit te breiden. Eerst wordt de ZIKV-vermeerdering gedurende 3 dagen uitgevoerd in Vero-cellen. Het kweeksupernatans dat ZIKV bevat, wordt geoogst en gekwantificeerd met behulp van de FFA. In het kort wordt de viruskweek geïnoculeerd op Vero-cellen en gedurende 2-3 dagen geïncubeerd. De vorming van foci wordt vervolgens bepaald na geoptimaliseerde kleuringsprocessen, waaronder celfixatie, permeabilisatie, blokkering, antilichaambinding en incubatie met peroxidasesubstraat. De gekleurde virushaarden worden gevisualiseerd met behulp van een stereomicroscoop (handmatig tellen in 24-wells-formaat) of software-analysator (geautomatiseerd tellen in 96-wells-formaat). De FFA geeft reproduceerbare, relatief snelle resultaten (3-4 dagen) en is geschikt om te worden gebruikt voor verschillende virussen, waaronder niet-plaquevormende virussen. Vervolgens is dit protocol nuttig voor de studie van ZIKV-infectie en kan het worden gebruikt om andere klinisch belangrijke virussen te detecteren.
Introduction
Zika-virus (ZIKV)-infectie is een opkomende door muggen overgedragen virale ziekte. De eerste isolatie van ZIKV was in Oeganda in 1947 1,2; Het bleef verwaarloosd van 1947 tot 2007, omdat de klinische symptomen meestal asymptomatisch zijn en worden gekenmerkt door zelfbeperkende koortsziekte. In 2007 begon de Zika-epidemie op de Yap-eilanden 3,4, gevolgd door grotere epidemieën in de Stille Oceaan (Frans-Polynesië, Paaseiland, Cookeilanden en Nieuw-Caledonië) van 2013 tot 2014 5,6,7,8, waar de ernstige neurologische complicatie Guillain-Barré-syndroom (GBS) voor het eerst bij volwassenen werd gemeld 9. In 2015 en 2016 raasde de eerste wijdverspreide ZIKV-epidemie over Noord- en Zuid-Amerika na de opkomst van het Aziatische genotype van ZIKV in Brazilië al in 201310. Tijdens deze uitbraak werden 440.000 tot 1,3 miljoen gevallen van microcefalie en andere neurologische aandoeningen gemeld bij pasgeboren baby’s. Er is momenteel geen specifieke remedie of behandeling voor ZIKV-infectie; daarom is er een dringende medische behoefte aan ZIKV-vaccins die infecties kunnen voorkomen, vooral tijdens de zwangerschap.
Viruskwantificering is een proces om het aantal virussen in een monster te bepalen. Het speelt een belangrijke rol in onderzoek en academische laboratoria betrekken veel gebieden, zoals geneeskunde en levenswetenschappen. Dit proces is ook belangrijk in commerciële sectoren, zoals de productie van virale vaccins, recombinante eiwitten, virale antigenen of antivirale middelen. Er kunnen veel methoden of tests worden gebruikt voor de kwantificering van virussen12. De keuze van methoden of tests hangt normaal gesproken af van de viruskenmerken, het gewenste nauwkeurigheidsniveau en de aard van het experiment of onderzoek. Over het algemeen kunnen methoden voor het kwantificeren van virussen worden onderverdeeld in twee categorieën: moleculaire tests die de aanwezigheid van viraal nucleïnezuur (DNA of RNA) detecteren en tests die de besmettelijkheid van virussen in vitro meten 12. Kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR, voor DNA) of kwantitatieve reverse transcriptie polymerasekettingreactie (qRT-PCR, voor RNA)13 en digitale druppel PCR14 zijn voorbeelden van veelgebruikte moleculaire technieken die worden gebruikt om het virale nucleïnezuur in een bepaald monster te kwantificeren15. Deze zeer gevoelige moleculaire technieken kunnen echter geen onderscheid maken tussen levensvatbare en niet-levensvatbarevirussen15. Daarom kan onderzoek waarvoor informatie nodig is over biologische kenmerken, zoals de besmettelijkheid van virussen op cellen, niet worden voltooid met behulp van de bovengenoemde moleculaire technieken; Er zijn tests nodig die de aanwezigheid van levensvatbare virussen kunnen meten en bepalen. Tests die de besmettelijkheid van virussen meten, zijn onder meer de plaquevormende test (PFA), 50% infectieuze dosis weefselkweek (TCID50), de fluorescerende focustest en transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)12.
De PFA, ontwikkeld door Renato Dulbecco in 1952, is een van de meest gebruikte methoden voor virustitratie, ook voor ZIKV16. Het wordt gebruikt om de virale concentraties voor infectieuze lytische virionen direct te bepalen. De methode is gebaseerd op het vermogen van een lytisch virus om cytopathische effecten (CPE’s; zones van celdood of plaques, een infectiegebied omgeven door niet-geïnfecteerde cellen) te produceren in een geïnoculeerde celmonolaag na virale infectie. Er zijn echter verschillende nadelen aan de test die van invloed zijn op het nut ervan. De test is tijdrovend (duurt ongeveer 7-10 dagen, afhankelijk van virussen), CPE-afhankelijk en foutgevoelig. In de huidige studie rapporteren we een immunocolorimetrische techniek, de focus forming assay (FFA), voor het detecteren en kwantificeren van ZIKV in plaatformaten met 24 putjes en platen met 96 putjes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn verschillende tests om de virustiter te bepalen; de PFA heeft een vergelijkbaar protocol voor het kwantificeren van virussen als de FFA, waarbij het virusinoculum wordt verdund om individuele plaques of foci te kunnen onderscheiden. Na kleuring duidt elke plaque of foci op een enkel infectieus deeltje in het entmateriaal19. De PFA is gekleurd met kristalviolet om plaquevorming veroorzaakt door cellyse of dood te visualiseren. Daarom is de PFA tijdrovender, omdat het virus meer tijd nodig h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek kreeg steun van het Ministerie van Hoger Onderwijs Maleisië in het kader van de Long-Term Research Grant Scheme (LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) en financiering voor het Higher Institution Centre of Excellence (HICoE) programma (MO002-2019). Figuur 3 in deze studie die de workflow van kleuring voor de foci-vormende test laat zien, is aangepast van “DAB Immunohistochemistry” door BioRender.com (2022). Opgehaald van https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.
Materials
| 0.22 µm Polyethersulfone syringe filter | Sartorius | S6534-FMOSK | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Nest | 615601 | |
| 10 mL sterile serological pipette | Labserv | 14955156 | |
| 1x Dulbecco’s phosphate-buffered saline (dPBS) | Gibco | 14190-136 | |
| 2.0 mL Screw cap tube | Axygen | SCT-200-SS-C-S | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 25 mL Sterile serological pipettes | Labserv | 14955157 | |
| 3,3'Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate | Thermo Scientific | 34065 | |
| 37 °C incubator with 5% CO2 | Sanyo | MCO-18AIC | |
| 5 mL sterile serological pipette | Labserv | 14955155 | |
| 50 mL centrifuge tube | Falcon | LAB352070 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning | 430725U | |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15) | MilliporeSigma | MAB10216 | |
| Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS) | N/A | N/A | 22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O |
| Biological safety cabinet, Class II | Holten | HB2448 | |
| CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer | ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL) | CTL-S6UNV12 | Commercial software analyzer |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS | |
| Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | MilliporeSigma | 12-349 | |
| Hemacytometer | Laboroptik LTD | Neubauer improved | |
| IGEPAL CA-630 detergent | Sigma-Aldrich | I8896 | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL |
| Inverted microscope | ZEISS | TELAVAL 31 | |
| Laboratory rocker | FINEPCR | CR300 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC) | Sigma-Aldrich | C5678 | |
| Multichannel micropipette (10 – 100 µL) | Eppendorf | 3125000036 | |
| Multichannel micropipette (30 – 300 µL) | Eppendorf | 3125000052 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Single channel pipettes (10 – 100 µL) | Eppendorf | 3123000047 | |
| Single channel pipettes (100 – 1000 µL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Single channel pipettes (20 – 200 µL) | Eppendorf | 3123000055 | |
| Skim milk | Sunlac Low Fat | N/A | Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining |
| Sodium Hypochlorite | Clorox | N/A | To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle | Terumo | SS10L21G | |
| Vero African green monkey kidney cells | – | ECACC 88020401 | Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization. |
References
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), (1952).
- Duffy, M. R., et al. Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2536-2543 (2009).
- Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clinical Microbiology and Infection. 20 (10), O595-O596 (2014).
- Cao-Lormeau, V. -. M., et al. Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013. Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).
- Dupont-Rouzeyrol, M., et al. Co-infection with Zika and dengue viruses in 2 patients, New Caledonia, 2014. Emerging Infectious Diseases. 21 (2), 381-382 (2015).
- Roth, A., et al. Concurrent outbreaks of dengue, chikungunya and Zika virus infections-an unprecedented epidemic wave of mosquito-borne viruses in the Pacific 2012-2014. Euro Surveillance. 19 (41), 20929 (2014).
- Tognarelli, J., et al. A report on the outbreak of Zika virus on Easter Island, South Pacific, 2014. Archives of Virology. 161 (3), 665-668 (2016).
- Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome-case report, French Polynesia, December 2013. Euro Surveillance. 19 (9), 20720 (2014).
- Faria, N. R., et al. Zika virus in the Americas: early epidemiological and genetic findings. Science. 352 (6283), 345-349 (2016).
- Rapid risk assessment: Zika virus epidemic in the Americas: potential association with microcephaly and Guillain-Barré syndrome – 4th update. European Centre for Disease Prevention and Control Available from: https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association (2015)
- Payne, S. Methods to study viruses. Viruses. , 37-52 (2017).
- Bustin, S. A., Mueller, R. Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).
- Sedlak, R. H., Jerome, K. R. Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).
- Bae, H. -. G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay. Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).
- Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 38 (8), 747-752 (1952).
- Nahapetian, A. T., Thomas, J. N., Thilly, W. G. Optimization of environment for high density Vero cell culture: effect of dissolved oxygen and nutrient supply on cell growth and changes in metabolites. Journal of Cell Science. 81, 65-103 (1986).
- Agbulos, D. S., Barelli, L., Giordano, B. V., Hunter, F. F. Zika virus: quantification, propagation, detection, and storage. Current Protocols in Microbiology. 43, (2016).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, (2013).
- Bolívar-Marin, S., Bosch, I., Narváez, C. F. Combination of the focus-forming assay and digital automated imaging analysis for the detection of dengue and Zika viral loads in cultures and acute disease. Journal of Tropical Medicine. 2022, 2177183 (2022).
- Dangsagul, W., et al. Zika virus isolation, propagation, and quantification using multiple methods. PLoS One. 16 (7), e0255314 (2021).
- Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
- Lazear, H. M., et al. A mouse model of Zika virus pathogenesis. Cell Host & Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
- Miner, J. J., et al. Zika virus infection during pregnancy in mice causes placental damage and fetal demise. Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).
- Kang, W., Shin, E. -. C. Colorimetric focus-forming assay with automated focus counting by image analysis for quantification of infectious hepatitis C virions. PLoS One. 7 (8), e43960 (2012).
- Brien, J. D., et al. Isolation and quantification of Zika virus from multiple organs in a mouse. Journal of VIsualized Experiments. (150), e59632 (2019).
- Payne, A. F., Binduga-Gajewska, I., Kauffman, E. B., Kramer, L. D. Quantitation of flaviviruses by fluorescent focus assay. Journal of Virological Methods. 134 (1-2), 183-189 (2006).
- Moser, L. A., et al. Growth and adaptation of Zika virus in mammalian and mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (11), e0006880 (2018).
- Ishimine, T., Tadano, M., Fukunaga, T., Okuno, Y. An improved micromethod for infectivity assays and neutralization tests of dengue viruses. Biken Journal. 30 (2), 39-44 (1987).
- Leiva, S., et al. Application of quantitative immunofluorescence assays to analyze the expression of cell contact proteins during Zika virus infections. Virus Research. 304, 198544 (2021).
- Lee, E. M., Titus, S. A., Xu, M., Tang, H., Zheng, W. High-throughput Zika viral titer assay for rapid screening of antiviral drugs. ASSAY and Drug Development Technologies. 17 (3), 128-139 (2019).
