Virusvermehrung und zellbasierte kolorimetrische Quantifizierung
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Vermehrung des Zika-Virus (ZIKV) in Nierenzellen von Vero-Afrikanischen Grünen Meerkatzen und die Quantifizierung von ZIKV unter Verwendung zellbasierter kolorimetrischer Immundetektionsmethoden in 24-Well- und 96-Well-Formaten (Hochdurchsatz).
Abstract
Das Zika-Virus (ZIKV) ist ein von Stechmücken übertragenes Virus der Gattung Flavivirus. Eine ZIKV-Infektion wurde mit angeborenen Hirnanomalien und möglicherweise dem Guillain-Barré-Syndrom bei Erwachsenen in Verbindung gebracht. Die Erforschung des ZIKV zum Verständnis der Krankheitsmechanismen ist wichtig, um die Entwicklung von Impfstoffen und Therapien zu erleichtern. Die Methode zur Quantifizierung von Viren ist im Bereich der Virologie von entscheidender Bedeutung. Der Fokusformungstest (FFA) ist ein Virusquantifizierungstest, der das virale Antigen mit Antikörpern nachweist und die Infektionsherde von Zellen mit Hilfe der Peroxidase-Immunfärbetechnik identifiziert. Die aktuelle Studie beschreibt das Protokoll zur Ausbreitung und Quantifizierung des Virus sowohl im 24-Well- als auch im 96-Well-Format (hoher Durchsatz). Im Vergleich zu anderen ähnlichen Studien hat dieses Protokoll die Optimierung der Foci-Größe weiter beschrieben, was als Leitfaden dienen kann, um die Verwendung dieses Assays auf andere Viren auszuweiten. Zunächst wird die ZIKV-Vermehrung in Vero-Zellen für 3 Tage durchgeführt. Der ZIKV-haltige Kulturüberstand wird geerntet und mit Hilfe der FFA quantifiziert. Kurz gesagt, die Viruskultur wird auf Vero-Zellen inokuliert und für 2-3 Tage inkubiert. Die Foci-Bildung wird dann nach optimierten Färbeprozessen bestimmt, einschließlich Zellfixierung, Permeabilisierung, Blockierung, Antikörperbindung und Inkubation mit Peroxidase-Substrat. Die gefärbten Virusherde werden mit einem Stereomikroskop (manuelle Zählung im 24-Well-Format) oder Software-Analysator (automatische Zählung im 96-Well-Format) visualisiert. Die FFA liefert reproduzierbare, relativ schnelle Ergebnisse (3-4 Tage) und eignet sich für den Einsatz bei verschiedenen Viren, einschließlich nicht-plaquebildender Viren. In der Folge ist dieses Protokoll nützlich für die Untersuchung von ZIKV-Infektionen und könnte zum Nachweis anderer klinisch wichtiger Viren verwendet werden.
Introduction
Die Infektion mit dem Zika-Virus (ZIKV) ist eine neu auftretende, durch Stechmücken übertragene Viruserkrankung. Die erste Isolierung des ZIKV fand 1947 in Uganda statt 1,2; Sie blieb von 1947 bis 2007 vernachlässigt, da die klinischen Symptome meist asymptomatisch und durch eine selbstlimitierende fieberhafte Erkrankung gekennzeichnet sind. Im Jahr 2007 begann die Zika-Epidemie auf den Yap-Inseln 3,4, gefolgt von größeren Epidemien in den pazifischen Regionen (Französisch-Polynesien, Osterinseln, Cookinseln und Neukaledonien) von 2013 bis 2014 5,6,7,8, wo erstmals die schwere neurologische Komplikation Guillain-Barré-Syndrom (GBS) bei Erwachsenen berichtet wurde9. In den Jahren 2015 und 2016 breitete sich die erste weit verbreitete ZIKV-Epidemie über den amerikanischen Kontinent aus, nachdem bereits 2013 der asiatische Genotyp des ZIKV in Brasilien aufgetreten war. Während dieses Ausbruchs wurden 440.000 bis 1,3 Millionen Fälle von Mikrozephalie und anderen neurologischen Erkrankungen bei Neugeborenen gemeldet11. Derzeit gibt es keine spezifische Heilung oder Behandlung für die ZIKV-Infektion. Daher besteht ein dringender medizinischer Bedarf an ZIKV-Impfstoffen, die in der Lage sind, Infektionen insbesondere während der Schwangerschaft zu verhindern.
Die Virusquantifizierung ist ein Verfahren, um die Anzahl der in einer Probe vorhandenen Viren zu bestimmen. Sie spielt eine wichtige Rolle in der Forschung, und akademische Laboratorien umfassen viele Bereiche, wie z. B. Medizin und Biowissenschaften. Dieser Prozess ist auch in kommerziellen Bereichen wichtig, wie z. B. bei der Herstellung von viralen Impfstoffen, rekombinanten Proteinen, viralen Antigenen oder antiviralen Wirkstoffen. Viele Methoden oder Assays können für die Virusquantifizierung verwendet werden12. Die Wahl der Methoden oder Assays hängt in der Regel von den Eigenschaften des Virus, dem gewünschten Genauigkeitsgrad und der Art des Experiments oder der Forschung ab. Im Allgemeinen können Methoden zur Quantifizierung von Viren in zwei Kategorien unterteilt werden: molekulare Assays, die das Vorhandensein von viraler Nukleinsäure (DNA oder RNA) nachweisen, und Assays, die die Virusinfektiosität in vitro messen 12. Die quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR, für DNA) oder die quantitative reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR, für RNA)13 und die digitale Tröpfchen-PCR14 sind Beispiele für gängige molekulare Techniken, die zur Quantifizierung der viralen Nukleinsäure in einer bestimmten Probe verwendet werden15. Diese hochempfindlichen molekularen Techniken können jedoch nicht zwischen lebensfähigen und nicht lebensfähigen Viren unterscheiden15. Daher können Forschungsarbeiten, die Informationen über biologische Merkmale wie die Infektiosität von Viren auf Zellen erfordern, nicht mit den oben genannten molekularen Techniken abgeschlossen werden. Es werden Assays benötigt, die das Vorhandensein lebensfähiger Viren messen und bestimmen können. Zu den Assays, die die Virusinfektiosität messen, gehören der Plaque-bildende Assay (PFA), die infektiöse Dosis von 50 % der Gewebekultur (TCID50), der Fluoreszenz-Fokus-Assay und die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)12.
Die PFA, die 1952 von Renato Dulbecco entwickelt wurde, ist eine der am häufigsten verwendeten Methoden zur Virustitration, auch für ZIKV16. Es wird verwendet, um die Viruskonzentrationen für infektiöse lytische Virionen direkt zu bestimmen. Die Methode basiert auf der Fähigkeit eines lytischen Virus, zytopathische Effekte (CPEs; Zelltodzonen oder Plaques, ein Infektionsbereich, der von nicht infizierten Zellen umgeben ist) in einer inokulierten Zellmonoschicht nach einer Virusinfektion hervorzurufen. Der Assay hat jedoch mehrere Nachteile, die sich auf seinen Nutzen auswirken. Der Assay ist zeitaufwändig (dauert ca. 7-10 Tage, je nach Viren), CPE-abhängig und fehleranfällig. In der vorliegenden Studie berichten wir über eine immunkolorimetrische Technik, den Focus Forming Assay (FFA), zum Nachweis und zur Quantifizierung von ZIKV in 24-Well-Platten- und 96-Well-Plattenformaten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt mehrere Assays, um den Virustiter zu bestimmen. Die PFA hat ein ähnliches Protokoll zur Virusquantifizierung wie die FFA, bei der das Virusinokulum verdünnt wird, um die Unterscheidung einzelner Plaques oder Herde zu ermöglichen. Nach der Färbung weist jede Plaque oder jeder Herd auf ein einzelnes infektiöses Partikel im Inokulum19 hin. Das PFA wird mit Kristallviolett gefärbt, um die Plaquebildung durch Zelllyse oder Zelltod sichtbar zu machen. Daher ist die PFA zeitaufwändiger, da…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde vom malaysischen Ministerium für Hochschulbildung im Rahmen des Long-Term Research Grant Scheme (LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) und der Finanzierung des Higher Institution Centre of Excellence (HICoE)-Programms (MO002-2019) unterstützt. Abbildung 3 in dieser Studie, die zeigt, dass der Ablauf der Färbung für den focibildenden Assay aus “DAB Immunohistochemistry” von BioRender.com (2022) übernommen wurde. Abgerufen von https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.
Materials
| 0.22 µm Polyethersulfone syringe filter | Sartorius | S6534-FMOSK | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Nest | 615601 | |
| 10 mL sterile serological pipette | Labserv | 14955156 | |
| 1x Dulbecco’s phosphate-buffered saline (dPBS) | Gibco | 14190-136 | |
| 2.0 mL Screw cap tube | Axygen | SCT-200-SS-C-S | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 25 mL Sterile serological pipettes | Labserv | 14955157 | |
| 3,3'Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate | Thermo Scientific | 34065 | |
| 37 °C incubator with 5% CO2 | Sanyo | MCO-18AIC | |
| 5 mL sterile serological pipette | Labserv | 14955155 | |
| 50 mL centrifuge tube | Falcon | LAB352070 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning | 430725U | |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15) | MilliporeSigma | MAB10216 | |
| Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS) | N/A | N/A | 22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O |
| Biological safety cabinet, Class II | Holten | HB2448 | |
| CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer | ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL) | CTL-S6UNV12 | Commercial software analyzer |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS | |
| Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | MilliporeSigma | 12-349 | |
| Hemacytometer | Laboroptik LTD | Neubauer improved | |
| IGEPAL CA-630 detergent | Sigma-Aldrich | I8896 | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL |
| Inverted microscope | ZEISS | TELAVAL 31 | |
| Laboratory rocker | FINEPCR | CR300 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC) | Sigma-Aldrich | C5678 | |
| Multichannel micropipette (10 – 100 µL) | Eppendorf | 3125000036 | |
| Multichannel micropipette (30 – 300 µL) | Eppendorf | 3125000052 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Single channel pipettes (10 – 100 µL) | Eppendorf | 3123000047 | |
| Single channel pipettes (100 – 1000 µL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Single channel pipettes (20 – 200 µL) | Eppendorf | 3123000055 | |
| Skim milk | Sunlac Low Fat | N/A | Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining |
| Sodium Hypochlorite | Clorox | N/A | To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle | Terumo | SS10L21G | |
| Vero African green monkey kidney cells | – | ECACC 88020401 | Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization. |
References
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), (1952).
- Duffy, M. R., et al. Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2536-2543 (2009).
- Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clinical Microbiology and Infection. 20 (10), O595-O596 (2014).
- Cao-Lormeau, V. -. M., et al. Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013. Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).
- Dupont-Rouzeyrol, M., et al. Co-infection with Zika and dengue viruses in 2 patients, New Caledonia, 2014. Emerging Infectious Diseases. 21 (2), 381-382 (2015).
- Roth, A., et al. Concurrent outbreaks of dengue, chikungunya and Zika virus infections-an unprecedented epidemic wave of mosquito-borne viruses in the Pacific 2012-2014. Euro Surveillance. 19 (41), 20929 (2014).
- Tognarelli, J., et al. A report on the outbreak of Zika virus on Easter Island, South Pacific, 2014. Archives of Virology. 161 (3), 665-668 (2016).
- Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome-case report, French Polynesia, December 2013. Euro Surveillance. 19 (9), 20720 (2014).
- Faria, N. R., et al. Zika virus in the Americas: early epidemiological and genetic findings. Science. 352 (6283), 345-349 (2016).
- Rapid risk assessment: Zika virus epidemic in the Americas: potential association with microcephaly and Guillain-Barré syndrome – 4th update. European Centre for Disease Prevention and Control Available from: https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association (2015)
- Payne, S. Methods to study viruses. Viruses. , 37-52 (2017).
- Bustin, S. A., Mueller, R. Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).
- Sedlak, R. H., Jerome, K. R. Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).
- Bae, H. -. G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay. Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).
- Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 38 (8), 747-752 (1952).
- Nahapetian, A. T., Thomas, J. N., Thilly, W. G. Optimization of environment for high density Vero cell culture: effect of dissolved oxygen and nutrient supply on cell growth and changes in metabolites. Journal of Cell Science. 81, 65-103 (1986).
- Agbulos, D. S., Barelli, L., Giordano, B. V., Hunter, F. F. Zika virus: quantification, propagation, detection, and storage. Current Protocols in Microbiology. 43, (2016).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, (2013).
- Bolívar-Marin, S., Bosch, I., Narváez, C. F. Combination of the focus-forming assay and digital automated imaging analysis for the detection of dengue and Zika viral loads in cultures and acute disease. Journal of Tropical Medicine. 2022, 2177183 (2022).
- Dangsagul, W., et al. Zika virus isolation, propagation, and quantification using multiple methods. PLoS One. 16 (7), e0255314 (2021).
- Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
- Lazear, H. M., et al. A mouse model of Zika virus pathogenesis. Cell Host & Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
- Miner, J. J., et al. Zika virus infection during pregnancy in mice causes placental damage and fetal demise. Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).
- Kang, W., Shin, E. -. C. Colorimetric focus-forming assay with automated focus counting by image analysis for quantification of infectious hepatitis C virions. PLoS One. 7 (8), e43960 (2012).
- Brien, J. D., et al. Isolation and quantification of Zika virus from multiple organs in a mouse. Journal of VIsualized Experiments. (150), e59632 (2019).
- Payne, A. F., Binduga-Gajewska, I., Kauffman, E. B., Kramer, L. D. Quantitation of flaviviruses by fluorescent focus assay. Journal of Virological Methods. 134 (1-2), 183-189 (2006).
- Moser, L. A., et al. Growth and adaptation of Zika virus in mammalian and mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (11), e0006880 (2018).
- Ishimine, T., Tadano, M., Fukunaga, T., Okuno, Y. An improved micromethod for infectivity assays and neutralization tests of dengue viruses. Biken Journal. 30 (2), 39-44 (1987).
- Leiva, S., et al. Application of quantitative immunofluorescence assays to analyze the expression of cell contact proteins during Zika virus infections. Virus Research. 304, 198544 (2021).
- Lee, E. M., Titus, S. A., Xu, M., Tang, H., Zheng, W. High-throughput Zika viral titer assay for rapid screening of antiviral drugs. ASSAY and Drug Development Technologies. 17 (3), 128-139 (2019).
